Developed by JoomVision.com

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

GTranslate

English French German Italian Portuguese Russian Spanish
Developed by JoomVision.com

HEMATOLOJİ LAB

antikoagulanlar

PDFPrintE-mail

Last Updated on Monday, 30 June 2014 22:19 Written by selime Monday, 30 June 2014 22:16

2.2.3.Antikoagülanlar

Katkı maddeleri, analitik proseslerden önce ölçülebilen bileşiklerin önemli derecede değişmemesini garantiye almak için kanın ve/veya plazmanın pıhtılaşmasını inhibe eden maddelerdir(3,6). Antikoagülasyon kalsiyum iyonlarının bağlanmasıyla( EDTA, sitrat) veya trombin aktivitesinin inhibe edilmesiyle(heparin, hirudin) sağlanır. Sözü edilen katı veya sıvı antikoagülanlar kan alındıktan hemen sonra kanla iyice karıştırılır. En önemli antikoagülanlar ve özellikleri şekilde sunulmuştur;( Şekil8)

1.     Sitrat: koagülasyon testleri için kullanılır. Oksalat da koagülasyon testleri için kullanılır.

2.     EDTA; hematolojik testler için kullanılır.

3.     Florur; glukoz tayinlerinde kullanılır.

4.     Heparin ise asit-baz durumları, çeşitli enzimler ve metabolitler ve iz elementler için kullanılır.

  • Koagülasyon testleri hemen hemen hemen daima sitratlı kan veya sitratlı plazmada yapılır.
  • Oxalatta  koagülasyon testleri için de uygundur ancak kullanılmamaktadır.  Sitratlı ile oksalatlı kan örnekleri karşılaştırıldığında faktör V stabilitesinden ve kalsiyum iyonlarını bağlamasından dolayı dezavantajlıdır.

o   EDTA, florur ve heparin koagülasyon testleri için uygun değildir

§  EDTA, koagülasyon faktör V ve faktör VIII’ in inaktivasyonuna neden olur.

§  Florur trombositlerin içindeki glikolizisi inhibe eder.

§  Heparin oldukça karışıklıklara yol açar ve yeterli araştırmalarla  değerlendirilememiştir

 

Şekil8. Antikoagülanlar ve  kan alma tüplerinin özellikler

 

Test prosedürleri ve analitlere göre değişik tipde plazma önerilmektedir. Tamponlu sodyum sitrat koagülasyon testleri için önerilmektedir. En önemli antikoagülanların özellikleri aşağıda anlatılmıştır.

 

2.2.3.1.EDTA

Edilendiamintetraasitik asidin tuzu. Dipotasyum(K2), tripotasyum(K3) ve disodyum tuzları(Na2) anhidr EDTA’dan hazırlanan 1.2-2.0 mg/ml kan(4.1 – 6.8 mmol/l kan) konsantrasyonları kullanılır.

2.2.3.2.Trisodyumsitrat :

109 mmol/L,kan antikoagülan oranı 9:1’dir. Trisodyumsitrat, dehitrat, C6H5Na3O7.2H2O( CAS numarası 6132-04-3; formül ağırlığı 294.1) olarak kullanılır.ICSH ve uluslar arası tromboz ve hemoztaz komitesi(ISTH) 109 mmol/L(32 g/L) sitrat sölüsyonunu önermektedir. Değişik antikoagülan/kan oranları PCV ≤ 0.20 ve ≥ 0.60 örnekler içinkullanılmaktadır. Koagülasyon testleri için tamponlu sodyum sitrat sölüsyonununu savunanlarda vardır. 129 mmol/L(%3.8’lik) sitrat solüsyonu 5.5 sulu bileşikler şeklinde hazırlanmıştır ancak artık üretilmemektedir. Yapılan çalışmalarda bu sodyum sitrat konsantrasyonunun koagülasyon deney sonuçlarını önemli ölçüde etkilediği birçok çalışmalarla gösterilmiştir.

2.2.3.2.1.     Tamponlu Sitrat Solüsyonu

0.100 – 0.136 mol/L sitrik asitli trisodyumsitrat. 21 mmol/L sitrik asitli 84 mmol/L trisodyumsitrat pH’sı 5.5-5.6 olan ise tamponlu sitrat solüsyonudur. % 3.2’lik ve % 3.8’lik(v/v) sitrat solüsyonu kullanıldığında INR sonuçları arasında farklılık olduğu bildirilmiştir. Dünya sağlık örgütü(WHO) ve  klinik laboratuarları standartları komitesi(NCCLS) %3.2’lik sitrik asitli sitratı önermektedir. Uluslar arası tromboz ve hemostaz komites(İSTH) ise hemostatik fonksiyonlarla ilgili bütün araştırmalarda Hepes tamponlu sitratın kullanılmasını önermektedir.

  • Bir hacim sitrat ile 9 hacim kan karışımı koagülasyon testleri için
  • Bir hacim sitrat ile dört hacim kan karışımı sedimantasyon hızı tayini için önerilmektedir.

2.2.3.3.Heparin

lityum veya sodyum tuzudur. Heparin karboksihemoglobin ve çinko tayinlerinde kullanılması önerilmektedir. Bu antikoagülan frajilite çalışmalarına ve kırmızı hücre enzim tayinlerinde eritrosit hücrelerinde değişiklik ve hemoliz yapmayan durumlarda önemlidir. Sodyum heparin( CAS numarası 9041-08-1) ve lityum heparin ( CAS numarası 9045-22-1) her mL kan için 12-30 internasyonel ünite konsantrasyonunda kullanılır. Lityum heparin önerilmektedir.

  • Standart heparinize plazma elde etmek için 12-30 IU/ml unfraksiyone sodyum, lityum veya molekül ağırlığı 3-30 kD olan heparinin amonyum tuzları önerilmektedir. İyonize kalsiyum tayinlerinde sıvı heparinizasyon için 8-12 IU/ml kan, kuru heparinizasyon için 40-60 IU/ml kan konsantrasyonlarında  kalsiyum-standart heparinden titre edilmiş heparin önerilmektedir.

2.2.3.4.Hirudin

Hirudin sülükten elde edilen veya genetik mühendislik prosesleriyle hazırlanan antitrombindir. Hirudin 1:1 hirudin-trombin kompleks oluşturarak trombini inhibe eder. Hiridun 10 mg/l konsantrasyonlarında kullanılır.

2.2.5.Asit Sitrat Dekstroz( ACD)

kan transfüzyonu servislerinde ve bazen eritrosit enzim testlerinde kullanılan antikoagülan asitsitratdekstrozdur.(ACD; trisodyumsitrat 22 g, sitrik asit monohidrat 8 g, dekstroz 25 g, suyla bir litreye tamamlanır).ACD(anticoagülan –sitrat-dekstroz) gibi katkı karışımları  kan toplanan tüplerde kırmızı kan hücrelerini korumaktadır. ACD’ nin iki förmülü vardı. Bu iki förmül arasındaki fark kan ile katkı maddesi oranıdır(Tablo 5).

Tablo5. ACD Formüllerinin Bileşimi

 

ACD A

ACD B

Sodyum sitrat

2.2 g/ dl

1.32 g/ dl

Anhidr sitrik asit

0.73 g/ dl

0.44 g/ dl

Dekstroz(glukoz)

2.45 g/ dl

1.47 g/ dl

ACD/kan(v/v)

1/5.67 g/ dl

1/3 g/ dl

pH

5.05 g/ dl

5.10 g/ dl

 

ACD A formülünde katkı maddesi- kan oranı 1: 5.67 iken ACD B formülünde ise katkı maddesi- kan oranı 1:3 dür. ACD kan örnekleri 1ºC – 6ºC’ de depolandığında kırmızı kan hücrelerini 21 gün korumaktadır.

 

2.2.4. Tüplerin İdendifikasyonu

 

Antikoagülan ve katkı maddesi içeren tüplerin kapaklarının renkli kodları vardır. Böylece kan alma işlemi sırasında tüpler doğru bir şekilde tanımlanır. Tüp kapakları İSO normlarına göre yapılmıştır.  Renkler ve etiket kodu genellikle tüpü tanımlamak için kullanılır. Vakumlu tüplerin renk kodlarında uluslar arası bir fikirbirliği yoktur. Harf kodları tüpleri tanımlanmasında kullanıldığı için zorunludur. Etiketlenmenin tam yapılması gereklidir çünkü  her sıvı kan veya plazma her laboratuar testleri için uygun değildir. Bundan dolayı eklenmiş antikoagülanlar  açık ve kesin bir şekilde tanımlanmalıdır ve tüplerin kapakları üzerine  renkli kapaklar olmalıdır ve  ve böylece birbiriyle karıştırılmamalıdır( Tablo6)(5-6). DIN İSO standartı 6710’ a göre antikoagülanları renk kodları şunlardır:

 

·       EDTA kodu lavanta/kırmızı

·       Sitrat 9+1: açık mavi/yeşil

·       Sitrat 4+1:  siyah/ leylak rengi

·       Heparin: yeşil/ oranj

·       Serum(katkı maddesi içermeyen ): kırmızı/ beyazdir. 

 

Tablo6. Tüplerin Tanımlanmasında Kullanılan Renk Ve Harf Kodları

Renk

 

Katkı maddesi

Harf kodu

Kullanılan diğer Alternatif renk

Kırmızı

Katkı maddesi içermeyen

Z

Beyaz

Kırmızı/gri

Serum separatör içeren

 

 

Lavanta

Dipotasyum EDTA

K2E

Krmızı

Disodyum EDTA

N2E

 

Tripotasyum EDTA

K3E

 

Açık Mavi

Tirsodyumsitrat(9:1)

9 NC

yeşil

Yeşil

Lityum heparin

LH

Oranj

Sodyum Heparin

NH

 

Gri / yeşil

Florur/EDTA

FE

 

Florür/heparin

FH

Sarı

Veriler N. Tatsumi, O.W. Van Assendelft, K. Naka, On Behalf Of The ICSH Expert Panel On Cytometry. İnternational Council For Standartization İn Haematlogy(ICSH) Recommendations For Single-Use Evacuated Containers For Blood Specimen Colletion For Hematological Analyses.Laboratory Hematoloy 8:1-6. 2002. Den Alınmıştır.

 

 

 

KOAGULASYON LABORATUARINA AİT TESTLERİ

PDFPrintE-mail

Written by selime Sunday, 29 June 2014 19:50

2.0. Koagülasyona Ait Laboratuar Testleri

          Rutin koagülasyon testleri, PT, APTT, fibrinojen ve Ddimer gibi geleneksel testler klinik karar verme proseslerinin önemli bir parçasıdır ve çoğu kez tanı ve tedaviye etki eder. Laboratauar diagnostiğinin diğer alanlarıyla benzerliğini; aktivitilerini preanalitik, analitik ve postanalitik faz için geliştirilen  üç-kısım proseslerle tanımlayabiliriz. Standartizasyon eksikliği ve hastanın idendifikasyonu ile ilgili prosedürler, analizlerden önce örneklerin toplanması, kullanılması ve prosesleri gibi bazı preanalitik faktörlerin monitorizasyonu test sonuçlarının güvenirliğini ters yönde etkilediğini gösteren kanıtlar vardır. Bu faktörlerin hasta sağlığı(bakım kalitesi) üzerinde etkileri oldukça fazladır ve hasta sonuçlarının doğruluğunu tehilikeye atabilir. Analitik teknikler, laboratuar instrumantasyonu, otomasyonu ve organizasyonundaki önemli gelişmeler son 50 yılda analitik kalitenin derecesini önemli derecede etkilemiştir. Üstelik akreditasyon ve sertifikasyon programları total analitik kalite sistemleri laboratuar diagnostiğinin bütün sektörlerinde  ortaya çıkmasını başlatmıştır. Bu sağlık bakım sektöründe ağır yük olan gereksiz giderleri azaltmış ve bu güveni ve itimatı geliştirmiştir. Bununla birlikte rutin koagülasyon test performanslarının kalitesi, güvenirliği çok artmıştır. Çoğunlukla örnek alınması ve kullanılması ile ilgili laboratuar çalışanlarının denetlenmesi veya direkt kontrolünde uzaklaşılmasını içeren operasyonlarla, analitik aşama dışındaki hataların düşüş gösterdiğiyle ilgili oldukça sağlam deliller vardır. Bunlar; hemolizden dolayı uygun olmayan test örnekleri, pıhtılı ve yetersiz örnekler, örneklerin kaybolması veya örneklerin laboratuara ulaşmaması, örneklerin yanlış ve yetersiz etiketlenmesi ve ve yanlış tanımlanması gibi hatalardır. Bundan dolayı preanalitik aşamada kalitenin gelişmesi çok önemlidir ve güvenilir staratejiler tanımlanmalı ve gereği şekilde uygulanmalıdır. Bu aşamada rutin koagülasyon testlerinin kalitesini ve güvenirliğinin azalmaması için bazı gereklilikler vardır. Bunlardan bazıları laboratuar diagnostiğinin diğer alanlarla ortaklığı ve diğeri ise kendisine özgüdür.(hastalar)(2).

            Filebotomi sağlık sektöründe ihmal edilen prosedürlerden biridir. Bununla beraber preanalitik değişkenliğin derecesinin çok yüksek olması kaliteyi ekilemektedir ve hala hem hasta hemde uzman için ciddi bir sağlık riski içermektedir. Deneyimli elemanların(uzmanların) eksikliği ve filebotomi işlerinin çok fazla olması kolaylıkla  önlenebilir hataların potansiyelini yükseltmektedir. Disposabil ve düz(straight) iğnelerin  ve vakumlu kan alma sistemlerinin girişi sürekli kaliteli  örneklerinin toplanmasını sağlamıştır ve ayıca hem güvenliği hemde pratikliği arttırmıştır. Bununla beraber tam prosedür ve başarı hızını bazı yönleriyle etkilemektedir. Hatalar test siklusunun herhangi bir kısmında oluşabilir, çoğunlukla hatalar filebotomi işleriyle ilgilidir. Bunlar günlük alınan örneklerin  çokluğu ve fileotomisitin iş yoğunluğunun oldukça yüksek olmasıyla ilişkilidir. Bundan dolayı hastanın doğru tanımlanması ana nokta olarak kalmaktadır. Örnek alma talimatlarında hastanın kimliğinin  doğru yazılması ve  doğrulanması şikayet olmaması için gereklidir. Barkodlu kol bileziğinin yaygın olarak benimsenmesi hasta tanımlama hataların azaltılması için  zorunlu olmalıdır.

            Uygun venlerin konumu bulmak başarılı kan alınması ve kaliteli örnekler için zorunludur ve şarttır. Bunun için antekubital alan filebotomi için en uygun yerdir ve kan almak için en iyi venler medyan kubital venlerdir. Ne yazıkki antekubital alan daima kolay bulunamamaktadır ve alternatif olarak sekonder ven girişleri bulunmalıdır. Bacak, ayak bileği, ayak venleri  kan almak için tercih edilmemelidir. Arterlerdeki atherosklerotik plaklarla kontakt yüzünden dolayı koagulabilitideki değişikliklerden dolayı inferior kol bacak venleri kan almak için kullanılmamalıdır. Fistula, şant, arteryel hatlar, kilitlerden, arterlerden, femoral ve varisli venlerden, mastektomi yapılan el ve koldaki venlerden kan alınması önerilmemektedir. Geleneksel alanlar kan almak için kullanılamayacağı durumlarda doktor kontrolünde kan alınmalıdır.

            Vakumlu kan alma tüpleri ile düz iğnelerin birleştirilmesi kan alma sistem tekniğinde köklü değişiklik yapmıştır. Sıradan enjektörlere göre büyük avantaj sağlamıştır. Bununla birlikte kelebek seti ve employing infusive routes gibi alternatif teknikler sıklıkla kan alma için kullanılmaktadır. Bunların kullanımı infuze edilen tedavilerin yönetimi için geliştirilmiştir. Bunlar sürekli diyalize giren ve kalıcı subkutan venöz kanulü olan hastalarda, uzun süreli infuze edilecek tedeviler için ameliyattan önce anestezi ve sedasyon için veya tehlikeli klinik ve diagnostik prosedürler gibi bazı durumlarda  uygulanabilir.  Kelebek setiyle kan alma genellikle yenidoğan, küçük çocuk,  sekonder venöz cihazı olan ve venleri zor bulunan hastalarda kullanılmalıdır. Ayrıca iğne fobisi olan sinirli ve tedirgin hastaların gözünü daha azkorkuttuğu için kelebek setleri bu hastalarda kullanılmalıdır. Kelebek setiyle kan almanın birkaç dezavantajı vardır. 

  • Maliyeti
  • hemolizli, pıhtılı, aktive olmuş örnek sayısı ve  
  • filebotomistin sağlık riski daha fazladır ve ayrıca tüplerin eksik doldurulması önemli bir olasılıktır(3).

Vakumlu tüplerle bileştirilen düz iğnelerden çok diğer alternatif kan alma sistemlerinin rutin koagülasyon testlerinin güvenirliği üzerine şimdiye kadar yapılan bilimsel çalışmalar çok azdır..

Venöz kan örneklerinin alınmasında iğne kullanılması kaçınılmazdır. İğneler temel olarak ölçü aygıtı(G) ile kalibre edilirler. G mm’lik olarak iğnenin çapından söz etmektedir. G numarasının büyüklüğü iğnenin deliğini çapının daha küçük olduğunu gösterir. Venden kan örnekleri alınırken genellikle 19-25 G’li iğneler kullanılır. 19-21 G’li iğneler primer olarak antekubital venden kan almak için sıklıkla kullanılır. 23 G ve daha küçükleri ise sekonder venler için kullanılır. Bununla birlikte iğne deliğinin büyüklüğünün rutin koagülasyon test sonuçları üzerine etkileriyle ilgili çalışma yoktur. Kan hücrelerinin rupturu  özellikle eritrositlerin hasarıyla ilişkili olduğundan, shear stres veya aşırı basınçtan sakınmak için kan örnekleri çok dikkatli alınmalıdır. Gerçekte, vakumlu tüplerle küçük delikli iğneler kullanıldığında çok büyük problemlerle karşılaşılmaktadır. Çünkü kan alırken büyük vakum uygulandığı için eritrositler üzerindeki shear strese neden olabilir ve invitro hemolizi ve  kanın pıhtılaşmasını arttırır ve iğnenin oklüzyonuna (kapatılmasına) neden olur ve koagülasyon aktivitesini arttırır. Venöz kan örneklerini almadan önce turnike uygulanması filebotomistin damarı bulmasına yardımcı olmak içindir. Turnike venöz kanı engellemek için  yeteri kadar sıkı olmalıdır ancak hastayı rahatsız etmemelidir ve kan akar akmaz çıkarılması gereklidir. Filebotominin çok hızlı olması beklenir. Ancak turnike uygulandıktan sonra bazı durumlarda uygulanış süresi uzayabilir. Uzamış venöz staz mutlaka kanda bazı analitlerin aktivitesi ve/veya konsantrasyonu etkiler. Kan örneklerinin alınması sırasında oluşan venöz staz bu yüzden önemli değişkenliklerin kaynağı olarak kabul edilmektedir. Bundan dolayı kan alma prosedürlerinin standatize edilmesiyle düzeleceği beklenilmektedir. Bunun için venleri uygun olan hastalara turnike uygulanmaması, iğneyle girildikten sonra  turnikenin hemen çözülmesi, kola uygulanan eksternal basıncın standartizasyonu, şişirilebilir elektronik cihazlar veya turnike uygulanışı ile örneklerin alındığı zamanı tam doğru saptayan kaydediciler kullanılabilir. Eğer birden fazla tüplere kan alınacaksa dikkatli ve aynı düzene uyulmalıdır. Kan alma tüplerinin sırasının doğrı bir şekilde kullanılmaması sonucu oluşan test interferansları koagülasyon laboratuarında karışıklıklara yol açar. Çünkü bu geleneksel kalite kontrol ve yeterlik test programlarıyla tayin edilememektedir. Rutin koagülasyon testleri için kullanılacak tüplerin sırasıyla ilgili tartışmalar hala devam etmektedir. 1970’lerin ortalarındaki gelişmeler ‘ kan alma emirleri’ ile test sonuçları üzerindeki etkilerini önlemeyi amaçlıyordu. Bu yıllarda tüp içindeki katkı maddelerinin iğneyle taşındığını gösteren bazı kontaminasyonlar ortaya çıkarılmıştır. Takip eden yıllarda emirler için radikal değişiklikler yapılmıştır. Enjektör ile alınan tüplere çizgi konularak kan alma çizgisi oluşturulmuştur. 1998 yılında standart organizasyonlar hem tüp-holder hemde enjektörle kan alma işlemini tek işlemde yapılmasını ‘yeni bir emir(order) önerdiler. Bu yıldan sonra pıhtı aktivatörü içeren plastik serum tüplerinin kullanılması yaygınlaştığı için bu emirlerin modifiye edilerek geliştirilmesi gerekli görülmüştür. Bundan dolayı plastik ve cam tüpler için iki farklı yol  geliştirilmiştir. 2003 yılında NCCLS kan ama işlemiyle diagnostik kan örneklerinin alınmasıyla ilgili prosedürlerinin etkileriyle ilgili önemli değişiklikleri bildirdiler. Bunlar hem cam hemde plastik tüplere uygulanabilen basit emirlerdi.Şu andan itibaren tam önerilen şıra şudur; ilk tüp kan kültürü tüpü, sonra katkı maddesi içermeyen, koagülasyon ve sonra katkı maddesi içeren tüplerdir. Sadece koagülasyon analizi talep edildiyse önce katkı maddesi içermeyen tübe kan örneği alınır. Bunun nedeni venden kan alınırken yapılan travma sonucu salınan doku tromboplastinile potansiyel kontaminasyonu uzuaklaştırmak içindir ki bu koagülasyon patywayinin aktive ederek  koagülasyon deneylerini interfere edebilir. NCCLS(CLSI) koagülasyon testleriyle ilgili ek öneriler geliştirmiştir. Koagülasyon tüpleri ilk tüp olarak kullanıldığında doku tromboplastinin sonuçları etkilemediğini son baskılarında yayımladılar. Ne aynı venden kan alma sırasında kan örneklerinin sırasal olarak ilk tüp veya ikinci tüpe kan alınması nede değişik koldaki venlerden ardışık olarak farklı kan alma arasında farklılıklar gözlenmemiştir.  Bunlar  rutin koagülasyon test sonuçlarında istatistiksel ve klinik olarak anlamlı farklılıklar  olmadığını gösteren  tutarlı delillerdir. Bu kılavuzda diğer koagülasyon testlerinde  discard tüp kullanılmasının en iyi durum olduğunu belirttiler.

Laboratuar tıbbının hiçbir aşamasında iyi ve doğru alınmış bir örneğe sahip olmak koagülasyon çalışmalarındaki kadar önemli değildir.Rutin koagülasyon çalışmaları için kabul edilebilecek tek örnek sodyum sitrat  (açık mavi kapaklı tüp) ile antikoagüle edilmiş kandır. Tüpün kanla yeteri kadar (ne az, ne çok) doldurulması bir diğer önemli noktadır. Çoğu koagülasyon testi için EDTA veya heparin ile antikoagüle edilmiş kan kabul edilebilir bir örnek değildir.

Örnek  tüpündeki plazmanın antikoagülana oranı da gözden kaçırılmaması gereken bir noktadır. Tüp az doldurulmuşsa veya hastanın hematokriti çok yüksekse plazmaya oranla antikoagülan fazla geleceğinden koagülasyon testleri yanlış olarak uzamış görünecektir. Bu nedenle az doldurulmuş tüpler laboratuara kabul edilmemeli ve yeni örnek talep edilmelidir.

Koagülasyon çalışması yapılacak kan örneği hiçbir şekilde kanül veya kateterden alınmamalıdır. Heparinin ufak bir damlası bile koagülasyon testlerinin bozulmasına yol açabilir.

Klinik laboratuarlarla ilgili majör hata kaynaklarından birisi kan örneklerinin uygun olmayan tüplere alınmasıdır. Uygunsuz örneklerin % 13-16’ sı tüplerin uygunsuz şekilde doldurulması ve karıştırılmamasıdır. Yanlış kan antikoagülan oranı ve pıhtılı örnekler hemolizden sonra ikinci ve üçüncü rejeksiyon nedenidir. Şimdiki kılavuzlar koagülasyon testleri için antikoagülan içeren kan örnek tüpleri doğru seviyede doldurulmalıdır( genellikle vakum volümü tamamlandığı zaman) ve hemoliz veya pıhtı içermemesi için nazikçe birkaç kez alt üst edilmelidir. Aşırı karıştırma hemolize neden olabilir. Gerçekte kan tüplerini eksik doldurulması PT ve APTT test sonuçlarının anlamlı şekilde etkileyebilir. Bu testlerin sonuçlarının hatalı olarak uzun çıkmasına neden olur. Ne yazıkki  tüplerin minimum doldurulması ile ilgili bir çizgi yoktur. Bu kesinleştirilmelidir. Örnektedeki antikoagülanın son konsantrasyonu ve kullanılan reaktiflerin sensitivitesi şişelerin özelliklerini etkileyeceğinden sonuçlar etkilenebilir. Vakumlu tüp materyallerinin koagülasyon testleri üzerine etkileri hala tartışmaya açıktır. Plastik tüplere alınan örneklerde PT değerlerinin cam tüplere alınan örneklerden analamlı derece düşük olduğu bazı çalışmalarla gösterilmiştir. Şimdiki NCCLS dökümanı koagülasyon örnekleri için vakumlu tüpler için beklenilen doldurma volümünün % 90 ınından az doldurulan tüplerin atılması gerektiğini önerdiler. Bu durumun filebotoimist tarafından sağlanması gerktiğini önerdiler.reatifk kompozisyonunun ve duyarlılığını reaktifler gibi spesifik test karakterleri olan veya test tüplerindeki final antikoagülan konsantrasyonu bilgisi olması gerekli değildir.

Kan örnekleri alındıktan sonra örneklerin stabilitesi daha fazla koagülasyon laboratuarının konusudur. Genellikle PT sonuçları mutlaka sabit depolama koşulları arasında kaldığında 24 saat stabildir.

NCCLS kılavuzu rutin koagülasyon testleri için örneklerin 1 saat içinde kapaklı olarak oda ısısnda 1500 x g’de 15 dakika santrifüj edilmesini önermektedir. Tam kan örneklerinin santrifügasyonu için alternatif ısıların koagülasyon test sonuçlarını veya oluşan sapmaların klinik veya analitik olarak anlamlı derecede etkilediğini gösteren kesin deliller yoktur. Isı derecesi kontrollü santrifüjler rutin koagülasyon testlerini tayininde açıkcası gerekmemektedir. Bundan dolayı preanalitik aşamanın bazı yönlerinin standartizasyonu ve kontrolü doğru ve güvenilir sonuçlar için önemlidir.

Hemostaz ve koagülasyonu incelemek için çok basitten (trombin sayımı, PT, PTT, fibrinojen düzeyi) oldukça karmaşığa pek çok farklı laboratuar testi vardır. Hemostaz bozukluklarının büyük çoğunluğu basit bir iki test, iyi bir anamnez ve fizik muayene ve biraz zihinsel analiz ile çözülebilir. Koagülasyon testleri için numunelerin alımı, taşınması ve işlemden geçirilmesine ilişkin bir prosedür kılavuzu gereklidir; çünkü pek çok değişken test sonuçlarını etkileyebilir (örn., antikoagülan miktarı ve konsantrasyonu, örnek ve numunenin saklanma süresi ve sıcaklığı, örneğin alınıp saklandığı tüplerin yüzeyi). Tanı ve tedaviyle ilgili önemli kararlar koagülasyon testlerinin sonuçlarına dayandığından, koagülasyon testlerinin genel performansı için kan numunelerinin alımı, taşınması ve işlemden geçirilmesine ilişkin prosedür kılavuzları gerekli görülmektedir. Aşağıda yaygın olarak kullanılan koagülasyon ile ilgili daha spesifik testleri etkileyen preanalitik faktörlerden ve kalite kontrolden bahsedilecektir(2-3).  

2.1. Koagülasyon Laboratuarı; Durumu, Problemler Ve Diagnostik Beklentileri

Modern bilim hastalıkların tanısında ve tedavisinde devrim yaratmıştır. Ultrason ve X-ray ile birlikte nükleer manyetik rezonansa dayalı metotlar ve laboratuar testleri hastalıkların gösterilmesinde duyarlılık sağlamıştır. Laboratuar testleri kantitatif, tekrarlanabilirlik ve birçok olayda spesifik sonuçlar sağladığı için hastalığın teşhisiyle bütünleşmiştir ve bu suretle hastalığın izlenmesi ve kontrolü sağlanmıştır. Laboratuar testleri sağlıklı popülasyonlarda risk faktörlerinin taranmasında geniş olarak da kullanılmaktadır. Genel olarak laboratuarlar değişik türlerde olabilir(4). Bunlar:

·       Hastanelerin acil laboratuarları ve yoğun bakım üniteleri 24 saat hızlı sonuçlar sağlayacak özelliktedir ancak sınırlı sayıda parametre çalışabilir.

·       Büyük merkez laboratuarları birçok değişik parametreleri çalışır, bazen sadece yüksek basınçlı sıvı kromotografisi, kütle spektofotometresi ve DNA analizleri gibi oldukça gelişmiş teknikler gerektiren testleri haftada yada ayda bir çalışabilir.

·       Medikal doktor merkezleri, aile doktorunun istediği testleri yapabilir.

·       Tarama laboratuarları; geniş popülasyonlarda neonatal taramalar gibi analizleri çalışır.

·       Kronik hastalıklı poliklinik hastaları için hasta başı testleri(point-care testleri, POCT), POCT prosedürleriyle koagülasyon durumu gösterilebilir veya glukoz değerleri çalışabilir.

Bu çok farklı gerekliliklerin ortak noktası; karışıklıkları hızlı bir şekilde çözmek; güvenilir, tekrarlanabilir, sensitiv, spesifik ve doğru sonuçları sağlamak içindir. Otomasyon ve modern aydınlatıcı teknoloji klinik laboratuarlardaki doğruluğu, tekrarlanabilirliği, hızı ve maliyeti ve önemli problemleri oldukça geliştirmiştir. Laboratuar testleri değişik uzmanlık ve teknikler  gerektirir ve bundan dolayı her alanda oluşan problemleri için çözüm alınmalıdır.

Dahiliye, cerrahi üniteler, nöroloji, oftalmoloji, ortopedi, radyoloji, jinekoloji ve diğer üniteler, acil üniteleri, yoğun bakım üniteleri ve ambulans servisi olan  büyük hastanelerin merkez klinik laboratuarları 24 saat çalışmalıdır. Günlük olarak toplanan kanlar analiz için merkez laboratuara gönderilir. Genellikle talep edilen kanların birçoğu kan sayımı, koagülasyon testleri, elektrolitler, enzimler vb gibi çok değişik parametrelerdir. Spesifik vakalarda değişik parametreler de talep edilebilir. Bütün laboratuar testleri hastanın operasyona hazırlanması gibi laboratuar test profilinde tanımlanmalıdır. Ayrıca  medikal laboratuar kalitatif ve kantitatif testleri, doktor/hastanın isteklerine göre düzenlemelidir. Ancak bu gereklilikler sıklıkla  ekonomik durumla tezattır bu sonuçla medikal ve finansal gereklilikler arasında ciddi uyuşmazlıklara neden olur.Örneklerin şematik pathwayı; hastadan alınan kan örneklerinin laboratuara transferi, analizi ve test sonuçlarının doktora/hastaya verilmesi Şekil 4’de gösterilmektedir. Diyagnoz veya tedavi gerekliliklerine dayanarak doktor veya hemşire laboratuar testlerini ya kağıt formu doldurarak yada elektronik olarak talep eder. Hasta örnek tüplerinin (primer) üzerine hastanın kimliği gösteren sıklıkla barkod veya etiket yapıştırılır. Talep ve örnek laboratuara gönderilir. Örnekler laboratuara ulaştığında tüpler santrifüj edilir, uygun analizörlere yerleştirilir. Analizördeki barkod okuyucusu tüp üzerindeki barkodu okur merkezi bilgisayarla karşılaştırır ve sonra taleplere göre analiz başlar.  Eğer analizler manuel olarak yapılacaksa  barkod okuyucusu analiz yapılan yere monte edilmelidir. Primer tüpten(kan alınan tüp) örneğin direkt tanımlanması analitik prosesler sırasında herhangi bir zamanda herhangi bir pozisyonda örnek tanımlanmasını sağlar.  Böylece örneklerin karıştırılması hatalarını azaltır.  Örneklerin analizinden sonra sonuçlar merkezi bilgisayara gönderilir. Sorumlu teknisyen analitik problemleri olan sonuçları kontrol eder ve kalite kontrol  değerlendirilir. Laboratuar uzmanı uygun bilgisayar programlarını kullanarak sonuçları değerlendirir. Eğer sonuçların doğruluğu uygun görülürse sonuçlar talep yapılan üniteye gönderilir. Bundan sonra doktor yada hemşire sonuçları yorumlar ve sonuçlara göre ilişki kurar.                                                                     

Kalite kontrol klinik laboratuar analizleri için yapılır. Kalite kontrol kullanılan testlerin uygulamalarına göre değişik seviyelerde olabilir. Analitik kalite; laboratuar metotlarının uzun dönem stabilitesini, prezisyonunu ve doğruluğunu gösterir. Rutin laboratuarda prezisyon kontrolleri test edilen her bir parametre değişikliklerinde en az bir kere çalışılmalıdır. Her laboratuarda kalitenin sürdürülmesi için eksternal kalite kontrol programları düzenli olarak yapılmalıdır. Bununla beraber bilgisayar  destekli delta kontroller olasılıklar kontrolü için kullanılmalıdır.

Preanalitik aşama sırasında analit konsantrasyonundaki değişiklikler olmaktadır. Preanalitik hata oluştuğunda, hatalar yapılan analizlerden önce oluştuğu için analitik sonuçlar doğrudur. Bazı vaklarda örnekteki analit konsantrasyonu hastanın kanındaki konsantrasyonu gösteremez. Bu tehlikeli hatalara ve hastanın sağlık durumunun yanlış yorumlanmasına yol açabilir. Kötü yazılar talep edilen laboratuar parametrelerinin uygun olmayan şekilde talep edilmesi(iyi tanımlanmayan) problem yaratır ve  sadece maliyeti değil, sonuçların hatalı yorumlanmasına neden olabilir.

Birçok sayıda değişken ya invivo olarak yada deney sırasında analitlerin konsantrasyonunu etkileyebilir.  İnterferans faktör in vivo olarak analitlerde değişikliklere sebep olur. Bunlar hastanın yaşı, cinsi, etnik, gebelik, menstrual siklus, diyet, açlık, egzersiz, alkol, sigara içme, ilave edilen ilaçlar ve uyarıcılardır. Bireylere bağlı değişiklikler laboratuar sonuçları yorumlanacağı zaman dikkate alınmalıdır. Sigara, alkol, diyet hastanın kaprisinden  dolayıdır. Bu durumlar vizit sırasında monitorize edilebilir.

Örnek yeri laboratuar sonuçlarını etkileyebilir. Hastanın duruş şekli kan alma sırasında birçok parametreyi etkileyebilir. Venöz yoldan kan alındığında turnike uygulanması birçok analitin konsantrasyonunu değiştirir. Çünkü yüksek moleküllü proteinler ve hücreler damar içinde kalırken, analitlerin intravasal sıvının ve düşük molekül ağırlıklı proteinlerin  ekstrasellüler boşluğa hareketinden dolayıdır. Yoğun bakım ünitelerinde en önemli ve en yaygın interferans laboratuar örneklerinin infüzyon solusyonlarla kontaminasyonudur. Heparinli kateterlerden kan örneklerinin toplanması koagülasyon test sonuçlarını önemli ölçüde etkiler. Bunlarla beraber bu etkilerin yanı sıra hemşirelerin hastayı devrederken yaptıkları hatalar da göz önünde bulundurulmalıdır. Özellikle örneklerin doğru tanımlaması garantiye alınmalıdır.

Serum ve plazma arasında dikkate değer farklar vardır. Serum fibrinojen içermez. Acil laboraturalarda tam kanda çalışılan bazı koagülasyon testleri rutin laboratuarlarda çalışılan plazma testleri  ile karşılaştırılması gereklidir.

Örneklerin merkez laboratuarlara transferi önemli problemler oluşturabilir. Klinisyen sıklıkla rutin sırasında uzun süren transferden şikayet ederler. Ancak sadece transfer zamanının uzaması değil, klinisyenin sonuçları elde etmesi de çok önemlidir. Çünkü analitlerin konsantrasyonu değişebilir. Birçok büyük hastanelerde otomatik transfer sistemi vardır, eğer örnekler doğru zamanda transfer edilmezse sonuçların kalitesine gölge düşer.

Kan örneği alındıktan sonra analitlerin serum veya plazma konsantrasyonu değişebilir. Böyle değişiklikler, değişik sayıdaki faktörlerden dolayıdır. Hastadaki analitlerin konsantrasyonu gösteren analitin değerinin dikkatli saptanması çok önemlidir. Örnekler santrifüj edildikten sonra hemoliz varlığının kontrol edilmesi çok önemlidir. Eritrositlerin lizisi intrasellüler proteinlerin salınımına neden olacağı için hatalı değerlere yol açabilir. Analitlerdeki en yaygın ve en önemli değişiklikler kan hücrelerinin metabolizmasından dolayıdır. Bundan dolayı örneklerin tam kanda uzun süre bekletilmemesi önerilmektedir.

Birçok koagülasyon deneyleri optik veya mekanik prosedürlerle in vitro koagülasyonu taklit eden pıhtı oluşumunun tayiniyle yapılır. Bu prosedürler çok değişkendir bazıları çok spesifik olmadığı için karşılaştırabilirlikle ilgili problemlere neden olabilir. Bugün  koagülasyon faktörleri immünolojik prosedürlerle veya fonksiyonel testlerle tayin edilebilir.

Sağlıklı ve hastalık durumlarına göre referans aralıkların tayin edilmesi gereklidir. Serum ve plazma için ayrı ayrı referans aralıkları saptanmalıdır. Örnekler dilüe edildiğinde problemler artacağı için dilüsyon faktörünün doğru hesaplanması çok önemlidir. Eğer talep edilen bütün parametrelerin tayinleri için örnek çok azsa örneğin dilüsyonu gerekebilir. Bu özellikle yeni doğan ünitelerinde gereksinimi karşılamak için doğru olabilir. 100 µl veya daha az plazma yeni doğandan elde edildiyse; bu durumda teknisyen talep yapan klinikle iletişime geçerek hangi parametrelerin önemli olduğunu bulmalıdır.

Analitik deneylerin standartizasyonu laboratuarlarda çok önemlidir. Mevcut olan birçok metot için referans metotlar çok iyi tanımlanmalıdır. Değişik metotlar değişik sonuçlara neden olabilir. Mümkünse aynı standart kullanılarak kalibre edilmelidir.

Analitik prosedürlerin kalite kontrolü, çalıştırılan kontrollerin prezisyonu ve eksternal kalite kontrol ile kontrol edilir. Hasta örnekleri analiz edilmeden önce eğer kontroller aralığın dışına düşerse problemler analizden önce çözülmelidir.

İnterferans faktörler eksojen ve endojen maddelerdir, Analitik metotları interfere ederek hatalı sonuçlara neden olur ve tayin edilen analitin konsantrasyonu in vivo durumuyla uyuşmaz. Hasta örneklerinde; dört önemli endojen interferans kaynağı vardır. Bunlar hemoliz, lipemi, bilirübinemi, ve paraproteinlerdir. Özellikle optik ölçümler kullanıldığında; hemoglobin (kırmızı), bilirubin (yeşil), ve lipitler (bulanık) gibi renkli interferanlar problemlere neden olabilir. Bunlar oluştuğunda analitik metotun değiştirilmesiyle üstesinden gelinebilir. Önemli eksojen interferanslar ilaçlar ve bunların metabolitleridir. Laboratuar analizleri çok kompleks olduğu için interferanslar çok önemlidir. Bunun için hakem literatürler okunmalıdır. Diğer bir problem ise örnekte bulunan fibrin iplikleridir. Bunun nedeni santrifügasyondan önce koagülasyonun yetersiz olmasıdır. Bu ipliklerin etkileri şunlardır; analitik analizörlerin pipetlerinde mekanik tıkanıklığa neden olabilir ve optik ölçümler sırasında küvette fibrin parçacıklarının bulunacağı için optik transparanlığı(saydamlığı) interfere edebilir.

Birçok post analitik hatalar yorumların doğru yapılmamasından ve laboratuar sonuçlarının doğru değerlendirilmemesinden kaynaklanır. Bu konuyla ilgili detaylı araştırmalar çok azdır.

Özetlersek hasta örneklerinin analizi için tanımlanan prosedürlerde preanalitik, analitik ve postanalitik aşamalar sırasında çok sayıda problemler gösterilmiştir. Farklı çalışmalarla test sırasında oluşan her hatayı analitik aşamaya yerleştirilmeye çalışılmıştır. Bu terimin hatalı olduğu gösterilmiştir. Bazı araştırıcılar laboratuarda oluşan hatalarla ilgili birkaç review tarzda çalışmalar yapılmıştır. Yapılan çalışmaların heterojenliğine rağmen hataların dağılımı ile ilgili çok önemli farklılıklar vardır. Hataların birçoğu preanalitik ve postanalitik aşama sırasında oluşur. Analitik aşamadaki hataların %13-32 arasında olduğu düşünülmektedir( Şekil 5).

Bundan dolayı her laboratuar hatalarının kaynağını araştırmalı ve yayınlamalıdır.  Bazı hataların ise referans aralıklardan kaynaklandığı ileri sürülmüştür böyle hatalar hasta bakım kalitesini etkilediği için laboratuarlar kendi normal aralık değerlerini çalışmalıdır. Normal olan bir sonucu anormal vermemek için her laboratuar kendi normal aralıklarını belirlemelidir.  Ev takip cihazlarında (POCT), POCT testlerindeki hataların birçoğu yine preanalitik aşama sırasında oluşur. POCT testlerinde transfer problemleri olmadığı için hataların çoğu kan örneklerinin ve verilerin yorumlanması arasındaki problemlerdir ve buda sadece bir veya iki hastayı kapsar. POCT’da metot seçimi çok önemlidir. Genellikle çalışmalar POCT analizlerinin merkez laboratuarında yapılan testler karşılaştırılarak performansı analiz edilmelidir. POCT analizleri sınırlı olduğu için kullanılacağı zaman mutlaka karşılaştırma çalışmalarının yapılması gerekir. POCT’un avantajı çok az bir örnek kullanır, örnekler uzun yol transferine uğramaz, hızlı medikal karar alınır, kişiye özgüdür. Dezavantajı dökümantasyonu ve kalibrasyonu yetersizdir, personel gerektirmediği için kalite kontrol ve bakımı uygun şekilde yapılamaz. Bundan dolayı bu cihazları merkez laboratuardaki ile karşılaştırmak zordur. Şu anda çok gerekli olduğunda sınırlı olarak kullanılmaktadır. POCT cihazları ile sınırlı sayıda testler çalışıldığı ve testleri pahalı olduğu için gelecekte POCT analizlerinin merkez laboratuarlar ile birleşeceğini gösteriyor(2, 4).

2.9.1.1. Aktive Pıhtılaşma Zamanı (ACT)

ACT, 1966 yılında acil durumlarda koagülasyon durumu ve heparinazyonun etkinliğini ölçmek üzere Lee White tam kan pıhtılaşma zamanından modifiye edilerek geliştirmiştir.ACT fibrin monomer formasyonunun tahmininde kullanılan tam kanda pıhtılaşmayı ölçen bir assaydir. Bügün bu deneyin birçok değişik modelleri vardır. Kaolin, celite veya her ikisinin karışımı gibi değişik aktivatörler kullanmaktadır ACT, negatif yüklü partiküller üzerinde kaolin, selit diatomit gibi bir koagülasyon aktivatörü bulunan tüplerde ölçülür. Tam kan tübe alındığında kontakt(temas) sistemi aktive olur ve pıhtılaşma başlar. Bu test, açık kalp ameliyatı gibi yüksek doz heparin kullanılan alanlarda yararlıdır ancak trombositlerden de etkilenir(55). 

ACT’de deneyi yürütülmeden önce kan örnekleri  37ºC‘de ılıtılır. Hatalı değerler bazı durumlarda elde edilebilir. Örneğin, CPB cerrahi sırasında postoperatif kanamayı minimize etmek için aprotinin verilen hastalarda deneyde kaolin aktivatörleri kullanılmadıkça hatalı düşük ACT değerleri çıkabilir. Bununa beraber bu prosedürler sırasında ister istemez oluşan hemodilüsyon bazı deneylerde ACT değerlerinin hatalı yükselmesine neden olur. Ancak bütün ACT testlerinin hepsi bu parametreler ile aynı derecede  etkilenmemektedir. Bu diğer koagülasyon sistemindeki bozukluklarda da muhtemelen görülebilir. Hipofibrinojemi ve ATIII eksikliği diğerlerinden daha çok bazı deneyleri etkiler. Değişik ACT metodolojiler kullanan bu denemelerin birçoğunda benzer ACT target değerleri polikilinik hastalarında elde edilen çalışmalarda yayınlanmıştır(56).

Manuel ACT bakma tekniklerinin yerini son yıllarda son derece sofistike mikro işlemci kontrollü aletler almıştır. Bunlardan bir kaçı aşağıda verilmiştir: Helena Laboratuarları (Beaumont, TX), ITC (Edison, NJ), Medtronics (Minneapolis, MN) ve Roche Diagnostics (Indianapolis, IN). Bu aletlerin çoğu aktive pıhtılaşma zamanı yanında  PT, aPTT, Trombin zamanı, fibrinojen seviyesi ve diğer hemostatik testlere de bakmaktadır. Bazı üretici firmalar, heparinaz içeren ayraçlar da sağlayarak başlangıçta heparin kullanan hastaların ACT’lerinin sağlıklı ölçülmesine imkan tanımaktadır. Bu aletler giderek artan yaygınlıkta direkt trombin inhibitörlerinin ve düşük moleküler ağırlıklı heparinlerin monitorizasyonunda hasta başında kullanılmaktadır(57-59).

2.9.1.2. Protrombin Zamanı (PT, Protime, Quick Testi, Parsiyel Protrombin zamanı)

Protrombin zamanı (PT) 1935’te Quick tarafından yapılan ilk tarifinden bu yana, kuşkulanılan kan koagülasyon bozuklukları olan hastaların laboratuar değerlendirmesinde önemli bir tarama testi olmaya devam etmektedir(55).

PT, koagülasyon sisteminin ekstrinsik yolunun (doku faktörü yolu)  bütünlüğü hakkında bilgi verir (Şekil 20). Hem vitamin K’ya bağlı faktörlere (faktör II, VII, IX, X) hem de ortak yolda yer alan faktörlere (fibrinojen, protrombin, faktör V, faktör X) karşı duyarlıdır PT, ekstrinsik koagülasyon yolundaki edinsel veya kalıtsal faktör eksikliklerinin saptanması amacıyla kullanılır. Oral antikoagülan tedavinin (coumadin) monitorizasyonunda standart olarak kullanılır(58-59)

PT testinde trombositten fakir bir plazma örneği 37 derecede doku faktörü, fosfolipid (tromboplastin) ve CaCl2 içeren bir reaktifle inkübe edilir. Pıhtı oluşması için geçen süre, çeşitli tekniklerle (foto-optik veya elektromekanik vs) ölçülür. Sonuç saniye cinsinden (protrombin zamanı) veya laboratuarın ortalama kontrol değerine oranlanarak (PT oranı) verilir. PT, testte kullanılan tromboplastinin özelliklerinden son derece etkilenir.

Uluslararası Normalizasyon Oranı (International Normalized  Ratio [INR])  dünya sağlık örgütü tarafından 1980’li yılların başlarında geliştirilmiş ve kullanıma sunulmuştur. Bu  amaçla ilk uluslararası hazırlama kaynağı (IRP) olarak bir insan beyni ekstresi belirlenmiş ve tüm ticari anlamda piyasada bulunan tromboplastin preparatlarının bu beyin ekstresine göre hesaplanan duyarlılıkları (ISI (International sensitivity index ) hesaplanarak bir düzeltme faktörü  belirtilmiştir. Tanım gereği ilk IRP olan beyin ekstresinin ISI’sı 1 olarak kabul edilmiştir. Daha sonra INR adında yeni bir kavram daha ortaya çıkmıştır. INR bilinen bir protrombin oranının IRP’ye göre düzeltilmiş halini göstermek amacıyla geliştirilmiştir. Ticari tromboplastin reaktiflerinin üzerinde her lot için geçerli olan ISI  verilmektedir. ISI bilindiği zaman her pıhtılaşma zamanı için INR değerini bulmak çok kolaydır. Ancak ISI da cihaz ve diğer laboratuvar şartlarından etkilenebilmektedir. Bu nedenle ISI her test alanında Amerikan Patologlar Kolejinin önerdiği standartlar doğrultusunda test edilmelidir. Maalesef INR’den sonra bile mevcut protrombin reaktif/cihaz kalibrasyon teknikleri, laboratuvarlar arasındaki sonuçların uyumlu olması için yeterli olamamaktadır(60,64). Bunun  yanında hem kanın pıhtılaşma şekli hemde tüplerin tipi, örneğin transportu, saklama koşulları, inkübasyon süre ve ısısı, reaktiflerin kalitesi ve son noktayı belirleme yöntemi gibi birçok faktörün PT üzerinde etkisi vardır(55).Ayrıca ;

  • Çeşitli medikasyonlar PT test sonuçlarını etkileyebilir. Warfarin gbi kan incelticileri, antibiyotikler, aspirin, cimetitin(Tagamet), barbitüratlar, doğum kontrol hapları, hormon replasman tedavileri ve vitamin K ilaveleri PT testini etkiler.
  • Vucut sıvı kaybına neden olan şiddetli kusma veya diyare ve dehidratasyon PT zamanını uzatabilir. Diyarede gıdalar, vitaminler, ve minerallerin gastrointestinal sistemden(malabsorbsiyon sendromu) absorbsiyonunun azalmasına neden olduğu durumlarda vitamin K eksikliği nedeniyle PT’ de artış olabilir.
  • Sığır eti (karaciğer), domuz eti (karaciğeri), yeşil çay, brokoli, nohut, ham kavun ve soyafasülyesi gibi vitamin K içeren yiyecekler
  • Aşırı alkol alımı
  • Laksatif kullanılması
  • Bazı bitkisel ürünler veya natürel ilaçlar  PT test souçlarını etkileyebilir.

PT testi; anormal kanamalar veya çürüklerin nedeni tayin etmek için, kanın pıhtılaşmasının engellenmesinde kullanılan warfarin gibi medikasyonların etkilerinin izlenmesinde, çeşitli pıhtlaşma faktörlerinin eksikliklerinin taranmasında, vitamin K eksiklikleri ve karaciğer fonksiyonlarının izlenmesinde kullanılır. Protrombin seviyeleri karaciğer fonksiyonlarının izlenmesinde aspartataminotransferaz(AST) ve alaninaminotransferaz( ALT) ile beraber izlenmelidir. PT testi için hastaların spesifik olarak hazırlanmasına gerek yoktur. Bununla beraber yemeklerden sonra kan örnekleri alınmamalıdır. Çünkü lipemi; pıhtı oluşumunda foto-elektrik ölçüm kullanan metotları interfere edebilir. Hiperbilirubinemi ve hemoliz de pıhtı oluşumu tayininde foto-optikal metotları kullanan yöntemleri interfere edebilir ve hatalı yüksek değerlere neden olur. Terapötik dozda heparin genellikle PTyi interefere etmez. Yüksek doz heparin alan hastalarda PT sonuçları uzun çıkabilir. Değişik tromboplastinlerin heparine sensitivitesinin değişkenliğinden dolayı warfarin tedavisiyle beraber aynı zamanda heparin tedavisi  başlananan  hastalarda ilk uygulanışı sırasında hatalı uzun PT değerleri çıkabilir. Yenidoğanlarda Vitamin K’ya bağlı pıhtılaşma faktörlerinin seviyesi düşük olduğu için Cord kanında PT değerleri uzun çıkar.

Hasta başı veya hastaların kendi kendilerine oral antikoagülan durumlarını ölçebilecekleri test sistemlerine giderek artan bir ilgi mevcuttur. Bu durum hasta açısından daha uygundur ve ilaç etkinliğini arttırmaktadır. Amerika Birleşik Devletleri’nde 600.000-900.000 arasında yapay kalp kapakçığı ile yaşayan hasta olduğu düşünülmektedir ve buna bir de hiperkoagülabilite nedeniyle oral antikoagülan kullanmak zorunda olan milyonlarca eklenirse çok sayıda evde kullanılabilecek ölçüm çubuklarıyla parmaktan alınan kanla ölçüm yapan “hastayla dost” PT ölçüm aletleri(POCT) mevcuttur. Avocet PT-Pro (Avocet Medical, San Jose, CA), Coaugucheck (Roche Diagnostics  Basel, İsviçre), Harmony INR Monitoring System (Lifescan Inc, Milpitas ,CA) INRatiometer (Hemosense, San Jose, CA)Hemos ProTime Microcoagulation System  (ITC, Edison NJ). Bu testler, Amerika Birleşik Devletleri’nde 2001 yılından beri sağlık güvence sistemleri tarafından karşılanmaktadır(65-70).

NCCLS; H47-A Tek-Basamaklı Protrombin Zamanı (PT) Testi ve Aktive Kısmi Tromboplastin Zamanı (APTT) Testi için Onaylanmış Kılavuzunda(NCCLS doküman H47-A) ; sitratlı plazma kullanılan klasik tekniklerle gerçekleştirilen rutin PT testinde; Tromboplastin ve bir kalsiyum iyonu kaynağı test plazması ile 37oC’de inkibe edilir; fibrin pıhtısının oluşumu için gerekli, saniye cinsiden zamandan PT saptanır. Son nokta ölçümleri manuel, yarı otomatik veya tam otomatik cihazlar kullanılarak çeşitli optik veya elektromekanik yöntemlerle yapılır. Manuel prosedürleri standardize etmek zordur ve bunlar yaygın biçimde kullanılmamalıdır71).

2.9.1.2.1. PT Testinin Standartize Edilmesi

PT pıhtılaşma zamanı olarak yıllarca  saniye olarak rapor edilmiştir. Pıhtılaşma prosesince PT reaktifinin değişik proteinlere duyarlılıkları değişken olabilir. Bir örnek için değişik reaktifler kullanılarak test edildiğinde  PT değerinde çok büyük bir farklılıklar oluşabilir. 1960’lı yıllarda hazırlanan ilk kullanılan tromboplastin reaktiflerinin duyarlılıklarının oldukça değişken olması ve  sonuçların saniye olarak ifade edilmesi  hasta izlenmesinde doğal olarak değişkenliklere yol açmıştır. O yıllarda protrombin zamanı oral antikoagülan kullanan hastaların izlenmesinde kullanılan  testti. Daha sonraki yllarda Protrombin zamanının saniye veya yüzde olarak ifade edilmesi yerine Uluslararası Normalize Edilmiş Oran’ın [International Normalized Ratio= INR] kullanımını Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tavsiye etmiştir. Böylece 1983 yılında  uluslararası ortak bir dil ortaya çıkmıştır. Hasta PT sonuçları MNPT’ ye oranlanarak sonuçlar standartize edilmiştir.

 

 

INR  =  [      hastanın PT değeri (saniye_________________ ]ısı

                     ortalama normal PT değeri(MNPT)(saniye)

 

·       ISI= Tromboplastin reaktifinin uluslararası duyarlılık endeksi

 

INR’nin tayin edilmesinden sonra uygun ilaç dozlarının ve antikoagülan seviyelerinin ayarlanmasında  oldukça  yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. INR değeri; insan beyninden hazırlanan tromboplastinler uluslar arası  referans hazırlama standartalarına göre hazırlanan tomboplastin duyarlılığı ile ilişkilidir. Standartizasyon 1983 yılında WHO tarafından farklı üretilen tromboplastin reaktiflerinin duyarlılığına bağlı olarak PT sonuçlarının yorumlanmasında temel oluşturmuştur. WHO’nun 1983’de getirdiği sistemle değişik test sistemleri için INR değerinin kullanılmaya başlanmasıyla PT reaktifleri arasındaki değişkenlik giderilerek standardizasyon sağlanmıştır.

Standartizasyon:Herhangi bir medikal tedavi gibi anti-vitamin K ajanıyla oral antikoagülan tedavisi (Warfarin gibi) alan hastaların da düzenli izlenmesi gereklidir. İlacın dozu düşük olduğunda  tromboembolik komplikasyonlar da yüksek olacağından kanama riskinden kaçınmak gereklidir. Protrombin zamanı tayinlerinde değişik tromboplastin  reaktifleri ve cihazları kullanıldığından raporlarda değişik çıkmaktadır. Bu karmaşayı WHO internasyonel standartize sistemi geliştirerek çözmüştür. Bu sisteme göre PT sonuçları matematiksel olarak INR’ye çevrilmektedir. Böylece oral antikoagülan tedavisinin değişik tedavi seviyelerinin raporlanmasının standartizasyonunda temel oluşturmuştur.

Standartizasyonda  sonuçların yorumu ve uygun şekilde kullanımı için eğitsel çalışmalar yapılmalıdır.

INR’nin oral antikoagülan tedavisinde sürekli ilaç alan hastalar için anlamı olduğu unutulmamalıdır. Karaciğer hastalığı gibi anormal PT değeri olan hastalarda veya en az bir hafta antikoagüle edilen hastaların koagülasyon durumunu değerlendirilmesinde kullanılmamalıdır.

Antikoagülan kullanan hastaların yönetiminde  INR rapor formatı geliştirilmelidir. INR için hastalar uygunsuz üç alt kümeye ayrılmalıdır.

  • İlki oral antikoagülan tedavisi alan sürekli hastalardır. Yakın zamanda tedaviye başlanan hastalar bu gruba uygun değildir.
  • İkinci grup hastalar karaciğer hastalığı olan hastalardır; bu hastalarda sıklıkla dolaşan faktör eksikliği olduğu için INR ile takip edilmemelidir.
  • Son grup faktör eksikliği olan hastalardır; bu hastalarda rutin olarak INR ile değerlendirilmemelidir.

 

ISI değeri INR’ nin hesaplanmasında önemlidir.  Çünkü ISI değeri formülün üs değeridir. Bunun sonucu olarak ISI’ daki küçük hatalar hesaplanan INR değerini çok fazla etkileyebilir.

Rekombinant teknoloji tekniği ile elde edilen tromboplastinlerin ISI değeri 1.0’e yakındır ve  doğru sonuçlar verdiği kabul edilmektedir.

Üreticiler reaktifleri hazırlarken tromboplastin reaktifini çalışma referansıyla karşılaştırdıktan sonra her bir tromboplastin reaktifinin her lotu için ISI değerini belirlemişlerdir. Bu çalışma referansı, uluslar arası kabul edilen  ISI değeri 1.0 olarak hazırlanmış referans standartlara karşı kalibre edilmiştir. ISI tahsisinde küçük değişiklikler hesaplanan INR değerini  çok etkileyebilir. ISI’ daki bu değişiklikler datalarda açıkça anlatılmalıdır.

 Tromboplastinler değişik kaynaklardan  ve değişik metotlar kullanılarak üretilmektedir. Her bir tromboplastininin duyarlılığının karşılaştırmaları oldukça değişkendir. En duyarlı tromboplastin reaktifinin PT sonucu en uzun olandır ve aksi durumda ise az duyarlı olan reaktif daha kısa sonuçlar vermektedir.

Değişkenlik her bir lot numarasına  bağlı olarak değişmektedir. Duyarlılıktaki bu değişkenliğin PT sonuçları üzerindeki etkisi antikoagülasyon gerektiren hastalarda warfarin tedavisini izlenmesinde zararlı etkileri olabilir. Birkaç on yıl içinde  bu değişkenlik oldukça büyük uluslar arası tartışmalar yaratmıştır. Bugün tromboplastinler duyarlılığı tanımlanmış ISI’ya ve ilk IRP’yle karşılaştırılarak kalibre edilmektedir.

Daha önce de vurgulandığı gibi, bir hastaya ait plazma örneğinde, ISI değerleri eşit olsa bile, farklı tromboplastinler kullanıldığında değişik INR değerleri elde edilebilmektedir. Tromboplastine bağlı olan değişkenliğin bir bölümü tromboplastin/cihaz sisteminin kalibrasyonu ile düzeltilebilmektedir. Bir bölümü ise kalibrasyon hatasına bağlı olamayıp, reaktif ile kan örneği arasındaki etkileşimden kaynaklanmaktadır.

En sık kullanılan tromboplastinler tavşan beyni ve insan plesentasından köken alan doku homojenatları ile hazırlanmakta ya da rekombinant doku faktörü ile sentetik fosfolipidlerin bileşiminden elde edilmektedir. Farklı kökene sahip olan bu reaktifler doğal olarak eşdeğer tepkimeler oluşturmamaktadır. Örneğin tavşan doku faktörü mutand yapıdaki faktör VII’yi aktive edebilmektedir. K vitaminine bağlı olan diğer faktörlerde de benzeri bir durum söz konusu olabilmektedir.

Tromboplastinin faktör VII ve faktör X ile etkileşimini etkileyen özellikler: tromboplastinin yayılma şekli-lameller yapısı, mevcut fosfolipid yüzeyi, içerdiği fosdolipidin yapısı (fosfatidil serin, fosfatidil etanolamin, fosfatidil kolin oranı ) ve bulunduğu bilayerdaki yüzey konsantrasyonudur. Doku faktörünün yüzey konsantrasyonu ve fosfolipid yüzeyinin toplamı tromboplastine bağlanabilecek faktör miktarını belirlemektedir. Bir doku faktör molekülüne bir faktör VII molekülü bağlanmasına karşın, faktör X’nun faktör Xa’ya dönüşme oranı mevcut doku fosfolipid moleküllerinin sayısına bağlı olarak değişmektedir. Faktör VII’nin fosfolipid molekülleri ile direkt etkileşimi, fosfolipid bileşimindeki farklılığın, pıhtılaşma faktörünün doku faktörüne olan affinitesinde  değişikliğe neden olmasına yol açmaktadır.

Gerçekten de, laboratuar uzmanları acısından kullanılacak tromboplastinin seçimi klinik için çok önemlidir.  INR ölçümlerinin doğruluğunu arttırmak için  ISI’ sı 1.0 olan tromboplastin reaktiflerinin kullanımı önerilmektedir. Laboratuardan sorumlu uzmanlar ezilmiş tavşan beyninden çıkartılarak ekstrakte edilerek elde edilmiş hazırlanmış ve ISI’sı 2 civarında olan konvansiyonel bir tromboplastini veya  ISI’sı 1’e yakın rekombinat bir tromboplastini kullanmayı tercih edebilir. Yeni rekombinant tromboplastinler genetik mühendislik yöntemleri ile elde edilmiş doku faktörü ve bir reaktiften diğerine farklılık gösteren fosfolipidlerin eklenmesinden meydana gelmektedir. Bunun sonucunda elde edilen rekombinant tromboplastinler bile birbirinin aynısı değildir. INR varyasyon katsayısının  ISI’daki artışla birlikte arttığı açıkça gösterilmiştir.

Ayrıca, bir laboratuardan diğerine elde edilen sonuçlardaki değişkenliğin, uzmanların kendi laboratuvarında kullanılan reaktifin ISI değerini bulundukları çalışma koşulları altında saptamaları ve yalnızca reaktif üreticisi tarafından belirtilen ISI değerini dikkate almakla yetinilmemesi  önerilmektedir. Bu durumda INR için kalibre edilmiş referans plazmalarının kullanımı önerilmektedir. Kullanılacak plazma tipinin seçimi çok önemlidir. K vitamini karşıtı ilaçlarla tedavi edilen hastalardan elde edilen insan plazması veya K vitaminine bağımlı faktörlerin immünolojik yönden baskılanması (supresyonu) ile elde edilen yapay plazma önerilmektedir. Dondurma-kurutma yöntemi ile elde edilen ve kalibrasyonda kullanılan plazmaların INR’sinde değişkenlik olduğu unutulmamalıdır(70-75).

2.9.1.2.2. INR’yi İnterfere Eden Maddeler

INR yi etkileyen faktörler tedavi monitorizasyonunda kullanılan PT testini  ve tedaviyi etkileyen nedenler olmak üzere ikiye ayrılabilir.

1. İlk kategori diyet değişiklikleri(vitamin K içeren yiyecekler), alkol alımı, diğer ilaçlar ve hastalıklar INR yi etkileyen değişikliklerdir. Bu faktörler INR’nin istenilen terapötik aralıklarda kalması için düzenli olarak hastaların monitorizasyonunu gerektirir. Bu faktörlerden bazıları aşağıda  tartışılmıştır.

·       Konjestive kalp yetmezliğinde kan akımının hepatik tıkanması sonucu warfarin metabolizmasının inhibe olmasından dolayı oluşabilir.

·       Hipotiroidizm: Vitamin K’ ya bağlı pıhtılaşma faktörlerinin katabolizmasını azaltır. Bundan dolayı hipotiroidizm’de eğer hastalarda genel olarak INR değerlerinde bir artış eğilimine doğru gidiyorsa warfarin dozunun azaltılması  gerekebilir.

·       Hipertiroidzm ise Vitamin K’ya bağlı pıhtılaşma faktörlerinin katabolizmasını arttırdığından; eğer böyle hastalarda INR değerlerinde artışa doğru bir eğilim varsa kumadin dozunun azaltılmasına gidilir.

·       Karaciğer yetmezliğinde, pıhtılaşma faktörlerinin üretimi azalacağından INR değerlerinde hafif yükseklik oluşabilir.

·       Vitamin K alımı, Vitamin K’ya bağlı pıhtılaşma faktörlerin üretimini arttırarak antikoagülan cevabın azalmasına yardım eder. Başka bir deyişle tüketimin azalması antikoagülan cevabı arttırır. Yüksek miktarda vitamin K içeren yiyecekler örneğin ıspanak, brokoli,  şalgam gibi yeşil yapraklı sebzeler ve ham olmamış meyvelerin alınması durumunda bu durum görülür.

·       İlaçlar: Warfarin metobolizmasını inhibe eden ilaçlar INR değerini arttırabilir. Örneğin amidorene kumadinin karaciğerde yıkımını inhibe ettiği için INR değerlerini arttırabilir.

·       Antikoagülan ve antitrombotik ilaçlar düşük molekül ağrılıklı ve heparin gibi ilaçlar INR değerinin yükselmesine neden olabilir. Çünkü bu ilaçlar direkt olarak koagülasyon kaskadını etkilerler.

2. İkinci kategori örnekteki heparin ve antifosfolipid antikorlar ve hematokrit düzeyleri INR değerlerini etkileyebilir. Bu faktörler aşağıda tartışılmıştır.

·       Örnekteki heparin : Heparin  bulunması INR düzeyinde yalancı artışa neden olabilir. Protrombin zamanı testleri  için  örnekler yerleşik vasküler kateterlerden alınmamalıdır. Bunlar heparinle fıskırtıldığı için örneği kontamine edebilir.

·       Antifosfolipid antikorlar: Pıhtı oluşum reaksiyonu için gerekli olan PT reaktifindeki fosfolipitler INR artışını yapay olarak etkileyerek hatalı sonuca neden olabilir.

·       Hematokrit: çok yüksek ve çok düşük hematokrit sonuçları tam kan örnekleri kullanan bazı sistem sonuçlarını etkileyebilir. Bu sistemler daima hematokrti aralığını kullanıcılarına belirtmelidirler(76-77).

2.9.1.2.3. PT Tayinlerindeki Hatalar

PT; kalsiyum ve tromboplastin varlığında fibrinojeni fibrine dönüştürmek için gerekli zaman olarak bilinir.  PT oral antikoagülan kullanan hastaların takibinde seçilmiş bir testtir. INR sistemi ilk tanımlandığında PT reaktifleri arasında görülen bu farklılığın giderileceğine inanılıyordu. Ancak çok sayıda değişken ölçülebilir olmadığından sistemlerin karşılaştırılmasında farklılıklar hala devam etmektedir(78-86). Bunlar.

  • PT tayinindeki hatalar

§  Deneyden önceki değişkenlikler

§  Manuel teknikteki değişkenlikler

  • MNPT değerinin yanlış olması
  • Tromboplastinin ISI değerinin yanlış olması

§  Kalibrasyonun yanlış olması

§  ISI  değerinde çok fazla değişkenliğin olması

§  Warfarinli örneklerin sağlıksız dağılımı

§  Referans seçiminin hatalı olması

 

  • PT Oranı veya INR değerinin yanlış dönüştürülmesi
  • Uygun olmayan plazmalar
  • Cihazların etkileri

Yukarıda görülen bu faktörler protrombin tayininde kullanılan sistemlerin birbirleriyle karşılaştırılmasında kullanılacağı zaman problemler oluşturabilir. Sistemlerin karşılaştırılmasında;

·       Warfarin tedavisinin ilk başlangıcında kullanılan reaktifler arasında INR değerlerinin karşılaştırılmasında hatalı sonuçların çıkması,

·       Yüksek ISI değeri olan reaktifler kullanıldığında doğruluğun ve prezisyonun daha düşük olması,

·       Üreticiler tarafından sağlanan ISI değerinin  güvenirliğinin eksikliğinin olması,

·       MNPT tayininde kullanılan kontrol plazmaların uygunsuz kullanımından dolayı INR değerinin yanlış hesaplanmasından problemler ortaya çıkmaktadır.

Kumadinin metabolizmasını etkileyen faktörler ve kumadinin mekanizması özellikle cihaz karşılaştırılmalarında farklılıklara neden olmaktadır. Bu farklılıklara yol açan faktörler:

·       Hastalıklar( konjestif kalp yetmezliği, hipo-hipertroidizm, karaciğer yetmezliği)

·       İlaçlar

·       Diet(vitamin K ve alkol)

·       Sadece PT testini etkileyen faktörlerdir.

·       Plazmayla ölçüm yapan sistemler  ile parmak ucundan alınan tam kanla yapılan çalışmalar karşılaştırıldığında konu ile ilişkili olan heparin, antifosfolipit antikorlar ve hematokrit gibi faktörler de önemlidir.

Sonuç olarak INR’nin 1983 yılında ortaya çıkışıyla, saniyelerle, yüzdelerle  veya hasta zamanının referans zamanına oranı (ingilizce konuşulan ülkelerde) olarak ifade edilen laboratuarlar arası protrombin zamanı sonuçlarındaki değişkenlik sorunlarına bir çözüm sağlamayı amaçlıyordu. Fakat 1985 yılından  itibaren INR’yi ölçmekte kullanılan yöntemin kusurları, özellikle de optik ve/veya mekanik okumayı kullanan ölçüm cihazlarına ilişkin değişkenlik ve aynı zamanda kökenlerine ve hazırlama yöntemlerine bağlı olarak reaktiflere (tromboplastinlere) ilişkin değişkenlikler saptandı.

INR doğruluğunu geliştirmek için yirmi yıl içinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, fakat bazı sorular hala yanıtsız kalmaya devam etmektedir. Klinik bakış açısından, INR’nin antikoagülan tedaviye başlanmasındaki geçerliliği tartışmalıdır, fakat sağladığı kolaylıklar nedeniyle onaylanmaktadır. Bazı belli hasta gruplarında örneğin, karaciğer yetmezliği olan hastalar, kardiyopatisi veya lupus antikoagülanı olan hastalarda tartışma hala devam etmektedir ve bu vakalarda INR hedefleri belirlenmelidir. Metodolojik bakış açısından ise, sonuçların laboratuarlar arası değişkenliği sorunu hala önemlidir.

            INR sitemlerinin ortaya çıkmasından sonra tromboplastin duyarlılıkları ile ilgili olan önemli değişikliklerin büyük bir bölümü uzaklaştırılmasıyla kumadin kullanan hastaların izlenmesi gittikçe ilerlemiştir. Koagülasyon çalışmalarında kullanılan tromboplastinlerin ISI tanımlamaları üretici ve sözleşmeli referans laboratuarlarda yapılır. Sodyum sitrat konsantrasyonu,  koagülasyon tüpleri, örneklerin alınışı ile analizi arasındaki süre ve ısılar gibi preanalitik değişikliklere duyarlılığı aynı gibi gözükmektedir. Örneğin  0.129 M soyum sitratlı tüplerde toplanan kan örnekleri tanımlanan ISI değerlerinden  0.109 M sitratlı tüplerden yaklaşık % 10 daha düşük olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Eğer laboratuar  üreticilerin tanımladığı ISI değerlerine güvenerek INR tayini yapıyorsa  üreticinin kullandığı  preanalitik uygulamalarına laboratuarın uygun olduğu da doğrulanmalıdır. Silikonlanmamış cam tüplerin kumadin monitorizasyonunda kullanılması oldukça tehlikelidir. Çünkü kumadin kullanan hastalarda soğuğa bağlı olarak PT değerlerinin kısa çıkması kumadin doz ayarlanması yapılan hastalarda uygunsuz doz artışına yol açabilir. Ancak  kumadin monitorizasyonunda PT  kullanıldığı için, PT’nin trombosit aktivasyonundan etkilenmediği için tüm preanalitik değişikliklerden APTT’ den (heparin monitorizasyonu) daha az etkilenir.

INR 1980 yılının başlarında oral antikoagülan tedavisinin  izlenmesinde değişik lotlı  tromboplastinlerin ve değişik kaynaklı tromboplastinlerin duyarlılığındaki değişkenliği önlemek için WHO tarafından  geliştirilmiştir ve hala INR oral antikoagülanların monitorizasyonunda ve hastaların doz ayarlanması da dahil edilerek birçok laboratuarlar tarafından kullanılmaktadır(78-86).

2.9.1.3. Aktive Parsiyel Tromboplastin Zamanı (aPTT, aktive protrombin zamanı)

Aktive kısmi tromboplastin zamanı (APTT) koagülasyonun intrinsik ve ortak yollarındaki kantitatif ve kalitatif anormalliklere duyarlıdır. Rutin laboratuar uygulamalarında protrombin zamanı dışında en sık gerçekleştirilen koagülasyon prosedürüdür. 

Parsiyel tromboplastin zamanı (PTT), plazmaya parsiyel tromboplastin eklendiğinde elde edilen pıhtılaşma zamanıdır. Parsiyel tromboplastin, bir doku ekstresinin fosfolipid fraksiyonudur ve tam tromboplastinden doku faktörü içermemesi nedeniyle ayrılır. Reaksiyona partiküller halinde silika, selit, kaolin, mikronize silika, ellagik asit gibi aktive edici bir ajan eklendiğinde PTT intrinsik yolda yer alan faktörlerin  ama en çok da kontak faktörlerinin (faktör XII, prekallikrein ve yüksek moleküler ağırlıklı kininojen) eksikliğine duyarlıdır (aktive PTT, aPTT). Bu testte parsiyel tromboplastin olarak birçok hayvan ve bitki (örneğin sefalin) orijinli reaktif ve bir dizi farklı aktive edici ajan kullanılmaktadır(55,87-102).

aPTT’de seyreltilmemiş trombositten fakir plazma 37 derecede bir aktivatör ve fosfolipid (parsiyel tromboplastin) ile beraber inkübe edilir. Daha sonra CaCL2 eklenir ve pıhtı oluşumuna kadar geçen süre mevcut tekniklerden herhangi biri ile (foto-optik, elektromekanik) ölçülür(şekil 21). aPTT sonucu, CaCL2 eklendikten sonra pıhtı oluşumuna kadar geçen süre olarak tanımlanır . aPTT ile intrinsik ve ortak yolda yer alan faktörlerin (faktör XII, XI, IX, VIII, V, II) fonksiyonel durumları belirlenir. aPTT, intrinsik yolda yer alan faktörlerin konjenital veya edinsel eksikliğini saptamak, heparin kullanan hastalarda monitorizasyon yapmak, faktör replasman tedavisi alanlarda tedavi etkinliği değerlendirmek ve intrinsik veya ortak yolda yer alan faktörlere karşı gelişen inhibitör varlığını saptamak amacıyla kullanılır (103-106).

aPTT, birçok preanalitik ve analitik etkenden etkilenebilir. Bu nedenle sonuçları değerlendirirken dikkatli davranmak gerekir. Preanalitik değişkenlere örnek olarak yavaş veya zor kan alınması, uygun olmayan kan/antikoagülan oranı, kanı hemen sitratla karıştırılmamış olması, örneğin kanın uygunsuz transportu veya saklanması, kan alımı ile testin yapılması arasında geçen sürenin uzun olması, eksk doldurulmuş tüpler, yüksek hematokrit, heparinle kontaminasyon, pıhtılı örnekler verilebilir. Testin faktör eksikliklerin, inhibitörlere ve heparine karşı duyarlılığı aynı zamanda testte kullanılan reaktiflere göre de değişkenlik göstermektedir. Bu kadar çok etkileşen faktör olması nedeniyle normal aPTT sonucunun hafif koagülasyon faktör eksiklikleri veya düşük titreli veya yavaş yanıtlı bir inhibitör olasılığını bulunabileceği unutulmamalıdır. Ancak ciddi bir aPTT uzaması, genellikle bir faktör eksikliğini ( Faktör VIII, IX, XI, XII, prekallikrein, YMAK), aPTT yanında PT de uzamış ise faktör I, II, V veya X eksikliğini akla getirir. aPTT  faktör VII ve XIII eksikliğinden etkilenmez.

Bazı bitkisel ürünler veya natürel ilaçlar, antihistaminler gibi bazı medikasyonlar APTT test sonuçlarını interfere edebilir.

Spesifik koagülasyon ilişkili maddelerin analizi için birçok aPTT modifikasyonu tanımlanmıştır. Rutine girmiş olanlarına reptilaz zamanı, Bethesda testi, protein C ve S aktivitesi , lupus antikoagülan testleri (dilüe Russel viper venom zamanı -dRVVT), trombosit nötralizasyon testi, hexagonal fosfolipid testi örnek olarak verilebilir.

Spesifik anti FVIII antikorları (inhibitörleri) hemofili hastaları için ciddi bir sorun oluşturmaktadır. Karışım çalışmaları, inhibitör varlığını saptayabilir. Ancak inhibitörün boyutunu belirlemek ve takibini yapabilmek için başka testlere de gereksinim vardır. Bethesda testi, aPTT temelli modifiye bir çalışmadır; FVIII inhibitörlerinin normal plazmadaki FVIII aktivitesini nötralize etme kabiliyetlerinin ölçümüne dayanır. Bir dizi farklı dilüsyonlarda hasta plazma, sabit miktardaki normal plazmaya eklenir. 37 derecede 2 saat inkübe edildikten sonra FVIII aktiviteleri belirlenir. FVIII aktivitesinin yarılanmış olduğu dilüsyon, Bethesda ünitesini belirlemek için kullanılır. Duyarlılığı artırmak amacıyla Bethesda çalışmasında bir çok modifikasyon yapılmıştır. Yeni Oxford testi temelde sistem olarak aynı olmakla beraber faktör VIII kaynağı olarak normal plazma yerine FVIII konsantresi kullanmaktadır. İnhibitörleri saptamak için enzim immünoassay, jel teknikleri gibi farklı yöntemlerde denenmektedir(107).

Direkt trombin inhibitörleri, warfarin, heparin veya düşük moleküler ağırlıklı heparin gibi indirekt olarak  antitrombin üzerinden çalışan antikoagülanların etkilerini artırmak ve yan etki profillerini elimine etmek maksadıyla son dönemlerde geliştirilen önemli antikoagülan ilaç gruplarından biridir. Eldeki direkt trombin inhibitörleri arasında Rekombinant hirudin (lepirudin), bivalirudin, argatroban, ve melagatran sayılabilir. Maalesef, bu ilaç grubu hemostaz laboratuarları için bir problem yaratmaktadır. Çünkü bu ilaçların varlığında konvansiyonel pıhtılaşma testlerinin (aPTT, ACT, TT) tekrarlanabilirliği ve linearitesi zayıflamaktadır. aPTT’nin iki modifikasyonu olan ecarin pıhtılaşma zamanı (ECT) ve protrombinazla indüklenen pıhtılaşma  zamanı (PiCT), direkt trombin inhibitörlerini monitorize etmek için kullanılmaktadır. Ayrıca bu ilaçlara yönelik kromojenik ve enzim immünoassay yöntemleri de mevcuttur. Mevcut durumda direkt trombin inhibitörlerini monitörize etmek için belirlenmiş optimal bir yöntem üzerinde net bir uzlaşma sağlanmamıştır. Ancak otomatize kromojenik yöntemler ve hasta başı  kromojenik testler yeterli duyarlılık, hassas ölçüm kriterlerine sahip gibi görünmektedir. Bu testlerde heparin ve diğer maddelerin etkileşimi de göz ardı edilebilmektedir(108-110). Low moleküle heparin tedavisi alan hastalarda antikoagülan tedavisini monitorizasyonunda kullanılması yararlı değildir.

APTT testi;

·       Hastada açıklanamamış kanama veya çürükler bulunduğunda,

·       Tromboembolizmde,

·       DIC gibi akut durumlarda veya karaciğer hastalığı gibi kronik durumlarda veya pıhtılaşma faktörlerinin aşırı hızda tüketildiğinde

·       Kanamalara neden olan durumlarda  

·       Hastada tekrarlayan düşükler veya trombotik ataklar olduğunda lupus antikoagülan veya antikardiyolipin antikorlarının değerlendirilmesinde  

·       Kanama eğilimi olan hastaların ameliyat öncesi değerlendirilmesinde(özellikle kanama öyküsü olan hastalarda kan kaybına neden olacağından ameliyat öncesi yapılmalıdır)

·       Burun kanaması ve çürükleri olan hastalarda

·       Herediter veya kazanılmış faktör eksikliklerinin tayininde veya kazanılmış inhibitör bulunduğunun gösterilmesinde

·       İntravenöz veya injeksiyon heparin tedavisinde, antikoagülasyonun derecesinin monitorizasyonunda (düzenli aralıklarla PTT testi takip edilmelidir).

·       Uzun süreli Warfarin tedavisinden heparin tedavisine değiştirildiğinde (hasta stabil olan kadar hem PT hemde APTT ile takip edilmelidir)kullanılır.

NCCLS; H47-A Tek-Basamaklı Protrombin Zamanı (PT) Testi ve Aktive Kısmi Tromboplastin Zamanı (APTT) Testi için Onaylanmış Kılavuzunda; sitratlı plazma kullanılan klasik tekniklerle gerçekleştirilen rutin  APTT testinde; Sitratlı test plazması, bir kontakt aktivatörü ve prokoagülan fosfolipidler karıştırılır ve 37oC’de enkübe edilir. Kontakt ajanı Faktör XI’i Faktör XII’ye aktive eder. Fosfolipdiler koagülasyon faktörlerinin aralarında etkileşimi için bir yüzey sağlar. İnkübasyondan sonra uygun konsantrasyonda kalsiyum iyonları eklenir ve pıhtı oluşumuna dek geçen zaman ölçülür. Son nokta ölçümleri manuel, yarı otomatik veya tam otomatik cihazlar kullanılarak çeşitli optik veya elektromekanik yöntemlerle yapılır. Manuel prosedürleri standardize etmek zordur ve bunlar yaygın biçimde kullanılmaz(71).

2.9.1.4. Trombin Zamanı (Trombin Pıhtılaşma Zamanı, TCT, TT) 

Trombin zamanı, trombin tarafından indüklenen fibrinojenin fibrine dönüşme sürecini, diğer bütün faktörleri bypass ederek direkt hasta plazmasında ölçer. Trombin zamanı, sitratlı hasta kanı üzerine düşük konsantrasyonda trombin (genellikle bovin  trombini) eklenmesi sonrası fibrin monomerlerinin oluşmasına kadar geçen sürenin görsel, mekanik veya opti-elektronik yöntemlerle ölçülmesi ilkesine dayanır. Trombin zamanı, trombin inhibitörlerinin veya fibrin oluşumunu/polimerizasyonunu  engelleyen faktörlerin varlığında uzar ancak trombin oluşumu sorunlarından etkilenmez. Klinik olarak trombin zamanı genellikle heparin tedavisinin monitorizasyonunda kullanılmıştır. Ayrıca heparin etkisi, hipofibrinojenemi, disfibrinojenemi, artmış fibrin yıkım ürünleri, diğer koagülopatilerden kaynaklanan paraproteinlerin varlığı gibi durumlarda ayırıcı tanı yaparken yardımcı olur. Kardiyotorasik cerrahi sonrası heparin ve trombolitik tedavi monitorizasyonlarında da kullanılır. Artmış plazma fibrinojen düzeyleri, trombin zamanında fibrin oluşmasına engel olarak bir uzama yaratabilir. Trombin zamanının referans aralığı, kullanılan trombine ve diğer faktörlere bağlı olarak değişmektedir(111-114).

Uzamış trombin zamanının en sık rastlanılan nedeni heparindir. Bu durum, in vitro şartlarda ortama heparinaz, protamin sulfat, Heptasorb veya heparini nötralize edebilen diğer maddelerin koyulması ile trombin zamanında düzelme görülmesi ile veya reptilaz zamanı ölçümü ile doğrulanır. Heparin etki gösterilemeyen durumlarda fibrinojen test edilmeli, inhibitör taraması ve dRVVT yapılmalıdır(55).

2.9.1.5. Fibrinojen

Fibrinojen, plazmada en fazla miktarda bulunan pıhtılaşma proteinidir.  Normal plazma seviyesi 200-400 mg/dl arasında değişmektedir. Koagülopatilerin tanı ve tedavisinde fibrinojenin kantitatif değerinin bilinmesi mutlaka gereklidir. PT ve APTT testleri fibrinojen ve faktör XIII eksikliklerini belirlemek için yeterli değildir. Bu testlerde fibrinojenin fibrine dönüşümü ölçülmektedir. Ancak daha sonra faktör XIII aracılığı ile oluşan polimerize olmuş fibrin hakkında bilgi edinilmektedir.Bazı miyokard enfarktüsü veya inme geçirmiş hastalarda fibrinojen düzeylerinin yüksek saptanmış olması nedeniyle trombotik hastalıklarda da fibrinojen düzeylerine bakılması önemlidir. Yıkanmış pıhtı metodu (total pıhtılaştırılabilir fibrinojen testi veya Dünya Sağlık Örgütü metodu) fibrinojen saptamak için referans yöntemdir. Bu metotta sitratlı plazma, epsilon aminokaproik asit varlığında (fibrin pıhtısının plazmin tarafından parçalanmasını engellemek için) uzun süre için trombinle beraber inkübe edilir. Diğer serum proteinleri yıkamalar yapmak sureti ile elimine edilir. Sonra pıhtı konsantre üre içinde eritilir ve fibrinojen konsantrasyonu kolorimetrik olarak ölçülür. Bu yöntem, çok sayıda numune ile uğraşan klinik laboratuarları için uygun olmamakla beraber otomatize cihazlarla yapılan fibrinojen ölçümlerinin her zaman doğruluk ve hassaslık açısından çok güvenilir olmadığını hatırlatmak yerinde olur(115).

Bazı defektlerine rağmen von Clauss tekniği ve Pıhtılaşma Hızı testi (Kinetik Fibrinojen Testi, protrombin zamanından türetilmiş metot) laboratuvarlarda en sık kullanılan iki yöntemdir. Von Clauss yöntemi, aşağıda anlatılan ilke doğrultusunda çalışır: tampon içinde 1:5 veya 1: 10 düzeylerinde dilüe edilmiş olan plazmaya yüksek konsantrasyonda trombin eklenmesiyle pıhtılaşma inhibitörlerinin etkisi ortadan kaldırılır ve ölçülen pıhtılaşma zamanı fibrinojen düzeyi ile doğru orantılıdır. Pıhtılaşma zamanları, standardize edilmiş bir eğri üzerinden okunarak fibrinojen seviyesi belirlenir. Bu test 50-800 mg/dl aralığında oldukça doğru sonuçlar verir. Ancak bu yöntem ile sadece in vitro pıhtıya dahil olan fibrinojeni ölçmekte işlev görmeyen anormal yapıdaki bir firinojenin varlığında bu konuda bir bilgi sağlanmamaktadır. Anormal yapıdaki bir fibrinojenin varlığında pıhtılaşmaprensibine dayanan testlere fibrinojen düşük ya da normal düzeylerde saklanırken immünolojik yöntemlerle tayin edildiğinde normal ya da yüksek saptanmaktadır.Von Clauss yöntemi, yüksek derecede teknik yetenek gerektirdiğinden son zamanlarda geliştirilen protrombin zamanı temelli bir test, laboratuarlar tarafından tercih edilir olmuştur(116). Bu testte trombin katalizörlüğünde fibrinojenin fibrine dönüşümü sırasında plazmanın bulanıklığındaki artış 450 nm’de ölçülür. Bu yöntem hızlı, ekonomik olmasının yanında tam otomatik aletlerle de yapılabilmektedir. Genellikle çok yüksek düzeylerde (ancak terapötik düzeylerde değil) heparin ve hirudin, fibrinojen pıhtılaşma testlerini yanıltabilmektedir ve hiperfibrinolitik aktiviteye sahip olduğu bilinen hastalarda aprotinin veya başka bir plazmin inhibitörü içeren özel bir tüp kullanılmadıkça test tamamlanmadan alınan kan örneğindeki fibrinojen düşmeye devam edecektir. Birçok çalışma, yıkanmış pıhtı yöntemi ve immünolojik testlerde ortamda fibrin yıkım ürünlerinin bulunmasının fibrinojen düzeylerinde yanlış yüksek sonuçlara, pıhtı temelli yöntemlerde ise yanlış düşük sonuçlara neden olabileceğini göstermiştir. Oral antikoagülan kullanan hastalarda kinetik yöntem kullanıldığında fibrinojen seviyelerinin von Clauss yöntemine nazaran daha yüksek çıktığı da bildirilmiştir(117).

Fibrinojen pıhılaşma faktörlerinden biridir ve kanın pıhtılaşmasında gerekli bir proteindir karaciğerde üretilir sonra dolaşıma bırakılır. Fibrinojen akut faz reaktanı olduğu için akut doku hasarlarında  veya inflamasyona neden olan durumlarda artar. Fibrinojen yükseklikleri spesifik değildir. Fibirinojen akut infeksiyonlarda, kanserde, koroner hastalıklarında, MI’da, şokda, inflamatuar hastalıklarda ve travmada fibrinojen seviyeleri yükselir. Bazen fibrinojen CRP ile birlikte kardiyak risk markerı olarak kullanılır

Fibrinojen genellikle diğer pıhtılaşma testleriyle beraber kullanılır. Fibrinojen kanın pıhtı oluşturma yeteneğinin değerlendirilmesinde kullanılır. Fibrinojen anormal PT ve APTTden sonra ve /veya açıklanamayan kanamalar veya uzun süreli olayları değerlendirmek için kullanılır. PT, APTT,trombosit sayısı, fibrin yıkım ürünleri ve Ddimerle bilikte DIC veya anormal fiirinolizisin tanısında yardımıcı olarak ölçülebilir. Ara sıra fibirnojen karaciğer hastalığı gibi progresiv hastalıkların izlenmesinde ve nadirende DIC  tedavilerinin izlenmesinde kullanılır.

Anabolik steroidler, androjenler, fenobarbitaller, streptokinaz, urokinaz ve valproik asit gibi bazı ilaçlar fibrinojen düzeylerinin düşmesine neden olabilir. Gebelikte, sigara içenlerde ve oral kontraseptif kullanan kişilerde fibirinojen seviyeleri hafif düzeyde artar. Disfibrinojemi nadir rastlanılan bir durumdur. Karaciğerde fibrinojen üretimini kontrol eden gendeki mutasyon sonucu oluşan koagülasyon bozukluğudur. Bunun sonucunda karaciğerin anormal fibrinojen yapmasına neden olur. Disfibrinojemi venoz tomboz riskini arttırır veya nadiren hafif kanama eğilimlerine neden olabilir ve PT, APTT,TT testleriyle birlikte bu durumun izlenmesinde kullanılır. fibirinojen eksikliği olan hastaların veya disfibrinojemisi olan hastaların yara iyileşmesi zayıf olabilir.

Fibrinojen bir akut faz reaktanıdır (yani çeşitli fizyolojik uyaranlar veya stresler plazma fibrinojeni ve diğer plazma proteinlerinde yükselmeye yol açar). Hiperfibrogenemi, trombozlu kişilerde protrombotik durum veya aşırı koagülasyona yatkın durum ile de ilişkilidir; gebelik gibi fizyolojik durumlarda fibrinojen yüksekliği bildirilmiştir. Fibrinojenin aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (ASKVH) gelişiminde olası bir risk faktörü olduğu ileri sürülmüştür. Buna bağlı olarak fibrinojen gelecekte ASKVH gelişme riskinin değerlendirilmesinde daha yaygın olarak kullanılabilir. Bu, laboratuar dahilinde ve laboratuarlar arasında kesinliği mükemmel olan testlerin kullanımını gerektirecektir. Fibrinojen ölçümü için kabul edilmiş bir referans plazmanın olmayışı, laboratuarlar arasında fibrinojen testinin kesinliğini azaltmıştır ve laboratuarlar çalışma standardının lotunu değiştirdikçe aynı laboratuar dahilindeki ileriye doğru kesinlik azalır. Fibrinojen tayini için iyi tanımlanmış referans plazmaların varlığı bu problemi hafifletecektir (örn., referans plazma Amerikan Patologlar Birliği’nden sağlanabilir(116,117).

NCCLS; Plazmada Fibrinojen Tayini için  Onaylanmış Kılavuzunda (NCCLS dokümanı H30-A) fibrinojenin kantitatif tayininde tercih edilen prosedür olarak Clauss trombin pıhtılaşma hızı testini önermektedir. En az 5 nokta kullanılarak referans eğrisinin hazırlanması vurgulanmaktadır(116).

2.9.1.6. D Dimer

Plazma D-Dimerleri endojen fibrinolitik sistemin fibrini yıkması ile oluşur. Fibrinojen ve fibrinden türeyen fibrin degradasyon ürünlerinin tersine D-Dimerler spesifik çapraz bağlı fibrin türevleridir. D dimer venoz tromboembolizmin dışlanmasında ve koagülabilitelerin değerlendirmesinde  kullanılan klasik koagülasyon markerıdır(117-125).

Fibrinolizin aktive olması solup olmayan fibrin yıkım ürünlerinin oluşmasına neden olmaktadır. Bunların en küçüğü D-Dimer olup, iki komşu fibrin monomerinden gelen ve  çapraz bağ ile birbirine bağlanan D domainlerini içermektedir(şeki 22). D-Dimer olarak adlandırılan bu özgün fibrin yıkım ürününün ölçümü, derin ven trombozu için duyarlı ancak özgün olmayan bir testtir. Koagulasyon aktivitesini günümüzde en iyi gösteren laboratuvar belirtecid

Plazma fibrinojeninn %2-3’ü plazmada fibrine yıkıldığından sağlıklı bireylerde düşük miktarlarda plazmada tespit edilebilir. Yarı ömrü yaklaşık 8 saattir. Plazmadan temizlenmesi retiküloendotelyal sistem ve üriner sistem yoluyla olur. D-Dimer seviyeleri fibrin oluştuğu ve plazmin tarafından yıkıldığı her durumda artar.

D-Dimer seviyeleri sağlıklı bireylerde de nadiren artmış bulunabilir. Venoz tromboembolik hastalıklar(DVT, PE), DIC, Akut koroner sendromlar, periferik damar hastalıkları, derin ven trombozu, embolizm(pulmoner emboli), hemoraji , operasyonlar, gebelik, karaciğer sirozu, intrauterin ölümler, trombolitik tedaviler akut inme, gebelik, orak hücreli anemide hemolitik krizler, malignite, cerrahi, konjestif kalp yetersizliği, kronik böbrek yetersizliği gibi fibrinin oluşumu ve yıkılmasını arttıran her durumda D-Dimer seviyeleri yükselir. Yaş artışıyla D-Dimer seviyeleri de doğrusal olarak artar. Yaşlılarda azalmış renal klirens, artmış plazma fibrinojeni ve sessiz hastalıkların varlığı bu duruma katkıda bulunur. Sağlıklı bireylerde yapılan bir çalışmada ortalama D-Dimer seviyelerinin 71-90 yaş arası bireylerde en yüksek olduğu gösterilmiştir

Trombotik hastalıklar dışında büyük cerrahilerde, kanamalarda travmaya bağlı olarak, malignitelerde ya da sepsiste yüksek olarak saptanabilmektedir. D-Dimer ölçümünde kullanılabilen birçok yöntem bulunmaktadır. Temel prensip çeşitli monoklonal antikorlar aracılığıyla özgün epitopların tanınmasıdır. Fibrinojen, fibrinojen yıkım ürünleri, fibrin monomerleri ile çapraz tepkime olmaması esastır(119-120).

Sonuçların yüksek oranda değişkenlik göstermesi, yöntem standardizasyonu henüz sağlanmamış olması önemli sorunlar arasında olup her laboratuvarın kendi cut-off değerlerini belirlemesini gerekli kılmaktadır. Bu farklılıkların bir bölümü oluşan fibrin yıkım ürünlerinin değişkenlik göstermesinden çeşitli antikorlara bağlı olarak gelişen farklı yanıtlardan, kalibratör ve kullanılan yöntemlerdeki farklılıklardan kaynaklanıyor olabilir. D-Dimer testinde değişkenlerin kaynakları:

·       Fibrin yıkım ürünlerindeki heterojenite

·       Antikorların özgünlüğü

·       Kalibratörler

·       Kullanılan yöntem

·       Sinyal okumasındaki doğruluk olabilir.

Ölçümü yapılan madde: D-Dimer yöntemindeki temel problemlerdendir. D-Dimer fibrin yıkım ürünleri arasında küçük bir miktarı oluşturmaktadır. D-Dimer içeren fragmanların bileşimi, klinik örnekler arasında farklılık gösterebildiği gibi, aynı kişide bile zaman içinde değişiklikler gösterebilmektedir.

 D dimer PT, APTT, fibrinojen gibi gelenksel rutin koagülasyon panelinin bir parçasıdır. Hem preanalitik hemde analitik fazın standartizasyonun doğruluğu, sonuçların doğruluğu ve tutarlılığının sürdülmesi çok önemlidir. Rutin koagülasyon assayleri ve Ddimer testi klinik kararları çok etkiler. Çünkü tromboembolik ve hemorajik bozuklukların diagnostik yaklaşımında ve heparin veya oral antikoagüların monitorizasyonunda çok önemli basamaktır. D dimer acil bir test olduğu için TAT zamanının kısa olması zorunludur. Değişik preanalitik prosesler de farklılıklar Ddimer deneylerinde farklı sonuçlar oluşturabilir. Dondurulan örneklerde ddimer konsantrasyonuyla ilgili çalışmalar vardır. Bu etkiler analizörün tipine ve transfer süresine bağlıdır. D dimer testi transfer zamanı, ölçüm zamanı, dondurma ve kullanılan analizörün tipine göre değişik preanalitik proseslerden etkilenebilir(117-125). Test sonuçların güvenirliğini etkileyen major preanalitik faktörler şunlardır:

·       Hantal kan alma sistemlerinin kullanılması

·       Tüplerin eksik ve yeteri derece karıştırılmaması

·       Örneklerin uygun olmaya bir şekilde muamele edilmesi gibi faktörler sonuçlarda sapmalara neden olur.

·       Bazı Ddimer assayleri, Romatoid faktör bulunmasına aşırı duyarlı oldukları görülebilir ve hatalı yüksek Ddimer seviyelerine neden olabilir

·       Lipemi immunuturbidimetrik ve ELISA assaylerini interfere edebilir.

D dimer fibrin yıkım ürünü olduğu için hem koagülasyon hemde fibrinolitik sistemin göstergesidir. Ddimer koagülasyon aktivitesinin bir markırı olduğu için fibrinojen seviyesi, FV, FVIII ve IX’le ilişkilidir. D dimer ölçümleri için hastaların spesifik olarak hazırlanmasına gerek yoktur.

Ddimer assayleri trombotik olayların tanımlanmasında kullanılan ilk basamak testlerinden biridir ve diagnositik sensitivitesi  > 99% sonuçlanmalıdır. Ayrıca D dimer assayleri DIC ve diğer prokoagülant durumların monitorizasyonunda ve teşhisinde kullanılır. Düşük Ddimer sonuçları fibrin formasyonu DIC veya venöz trombozis gibi akut durumları dışlar. Yüksek düzeyleri çeşitli durumların göstergesi olabilir bundan dolayı klinik durumlarda  yorumlanması çok önemlidir(120-125).

D dimer testi; başlıca ELİSA ve lateks yöntemleriyle ölçülür. Lateks olanlar da kendi içlerinde kantitatif ve semikantitatif olarak ayrılırlar.

  • ELIZA yöntemlerinin 24 saatlik kullanıma uygun olmamaları, tek bir örneğin hızlı olarak ölçülememesi ve kalifiye elemana ihtiyaç göstermesi en önemli dezavantajları arasındadır. Ancak son yılarda bir saat içinde sonuç verebilen hızlı yöntemler de geliştirilmiştir.
  • Lateks temelli testlerde, ölçümü yapılacak olan maddenin lateks partikülleri ile kaplı olan antikorları çöktürmesi esastır. Bu yöntemlerde örneğin sulandırmadan ya da çok az sulandırılarak çalışılmasına karşın ELİZA tekniklerinde örneği sulandırma oranı daha yüksektir.
  • Semikantitatif testler en ucuz ve en basit testler olmasına karşın, alt saptama sınırının çok düşük olmaması ve değerlendirmenin göz ile yapılması en önemli dezavantajlarını oluşturmaktadır.
  • Kantitatif yöntemler ise fotometrik ya da turbidimetrik olabilirler. Sıklıkla rutin koagulasyon ya da kimya analizörlerinde kullanılmak üzere üretilen on dakika içinde sonuç veren yöntemlerdir. En önemli avantajları tam otomatize olmaları ve göz ile değerlendirilmemeleridir. Ancak seçilen yöntemin analitik duyarlılığı ve alt saptama limiti oldukça önemlidir. Normal değerlerin ya da venöz trombo emboli cut-off değeri olarak belirlenen değerlerin kalibrasyon eğrisinin en alt kısımlarında kalıyor olması, o aralıkta yapılan ölçümleri yeteri kadar hassas yapılmasını engelleyebilir. CV değerlerinin düşük konsantrasyonlarda en yüksek değerlerde olması cut-off değerine yakın olan bölgelerde elde edilen sonuçların çok dikkatli yorumlanmasını gerektirmektedir.
  • Tam kan ile çalışılan semikantitatif testlerde ise D-Dimer ve eritrosit membranına karşı olmak üzere iki antikor kullanılmaktadır. Göz ile değerlendirilmesi önemli bir dezavantajdır. Kalite kontrol materyali olarak sıklıkla iki farklı seviye kullanılmaktadır. Semikantitatif  testlerde ise kit içinde negatif ve pozitif kontroller yer almaktadır. Henüz yöntem standardizasyonu bulunmadığından hedef değerler her bir yöntem için ayrı ayrı saptanmalıdır.

D-Dimer seviyelerinin pek çok patolojik ve hatta fizyolojik durumda yüksek tespit edilmesi bu tetkikin tromboembolik hadiselerin saptanmasındaki pozitif prediktif değerini azaltmıştır. Fakat, son 10 yılda D-Dimer ölçülmesi ile yapılan çalışmalar; ölçümlerin şüpheli tromboembolik olayların özellikle dışlanmasında pratik, güvenli ve maliyet-yararı olan bir tetkik olduğunu göstermiştir(117-125).

2.10.1. Spesifik Koagülasyon Test Metotları

2.10.1.1. Pıhtı Oluşumu Temeline Dayanan Testler

Pıhtı oluşumuna dayalı fonksiyonel testler, klinik laboratuarlarda yaygın olarak koagülasyon sisteminin intrensik ve ekstrinsik yollarının bütünlüğünü belirlemek amacıyla kullanılmaktadır (Şekil-3

Fibrinoliz ve diğer koagülasyon yollarını ölçmek amacıyla benzer fonksiyonel testler geliştirilmiştir.

Klinik koagülasyon laboratuvarlarında pıhtılaşma deneyleri protrombin zamanı, aktive parsiyel tromboplastin zamanı gibi testlerde kullanılmaktadır. Bu metotta; hemofiliak defektlerin veya spesifik faktör düzeylerinin belirlenmesi için doku fosfolipidlerinin bulunduğu ortama pıhtılaşmayı başlatmak için tam veya parsiyel doku tromboplastini, trombositten fakir plazmaya eklenir(Şekil- 31).Pıhtı oluşumu temelli testleri ölçen  bir çok otomatize cihaz piyasada mevcuttur: Dade Behring (Deerfield ,IL), Beckman Coulter (Fullerton , CA),  Diagnostica Stago (Parsippany, NJ), Global Medical Instrumentation (St. Paul, Minnesota), Sysmex Corporation (Kobe, Japonya). Ayrıca çok sayıda tam kan örneği kullanan hasta başı cihazlar da vardır. Bunlar arasında en fazla rağbet göreni, kardiyopulmoner bypass operasyonları sırasında pıhtılaşmayı monitorize etmek için kullanılan aktive pıhtılaşma zamanını ölçen cihazlardır(55).

2.10.1.2. Kromojenik Analiz( 176-178

Kromojenik analiz 1970’lerin başında geliştirilmiş olan bir enzim inceleme tekniğidir. Kromojenik testlerde incelenecek enzim için spesifik olan kısa bir amino asit rezidüsüne eklenmiş renkli kimyasal maddelerden (kromofor, kromajen) ibaret sentetik substratlar kullanılır. Enzimatik reaksiyon kromoforu serbestleştirir ve test sonuçları bir spektrofotometre ile okunur. Kromojenik substratların spesifisitesi enzimin kendi substratı ile benzer bazı durumlarda ise daha yüksektir. Kromojenik testlerin diğer avantajları arasında, ayraçlarının stabil kalmaları ve geniş bir kullanım alanı içinde otomatize aletlerde de (örneğin kimya ve immünolojide)  rahatlıkla  uygulanabilir olmalarıdır. Kromojenik substratın istenilen enzime seçiciliği, örnek ve reaktifin relatif konsantrasyonlarına, reaksiyon şartlarına (pH, ısı, tampon tipi, konsantrasyonu, iyonik kuvveti vb.) inhibitörlerin varlığına, substratın çözülebilirliğine ve stabilitesine vb. bağlıdır. En iyi substratlar enzim için yüksek afinite gösteren ve bağlanıp çözülme hızları da yüksek olan maddelerdir. En sık kullanılan substrat para-nitroanilin’dir (pNA). Bu maddenin maksimum absorpsiyon spektrumu 405 nm.’dir.(176-178)

Çoğu koagülasyon faktörünün analizinde faktör X’a yönelik kromojenik substratlar kullanılır. Örneğin Faktör VIII, Faktör IX’un bir enzimatik kofaktörüdür. Aktive faktör IX da faktör X’u aktif hale geçirir. Aktive faktör X bu basamaktan sonra kromojenik bir substratı hidrolize eder ve pNA kromoforu açığa çıkarır ve 405 nm.’de spektrofotometrede okunur (Şekil-32). Test şartları uygun şekilde kontrol edilirse açığa çıkan rengin yoğunluğu faktör VIII’in miktarı ile doğru orantılıdır. FVIII ölçmeye yönelik kromojenik analizin, antijenik yöntemler ve bir pıhtı bazlı aktivite testi ile karşılaştırıldığı bir çalışmada kromojenik faktör VIII analizi, hassas oluşu, lupus antikoagülan, heparin ve diğer ilaçlara karışmaması nedeniyle en optimal yöntem olarak bildirilmiştir.

Trombin, doku tipi plazminojen aktivatörü, ürokinaz, IX, X, XII koagülan faktörleri ve diğer bazı proteinler için ticari kitler Chromogenix’ten (Orangeburg, NY), Trinity Biotech, Wicklow, İrlanda) ve diğer firmalardan temin edilebilir(179-180).

2.10.1.3. Lateks Aglütinasyon ve Turbidimetre

Aglütinasyon, insolubl (çözülemeyen) veya partiküllü antijenler (hücreler veya partiküller) bir immün reaksiyonla birbirlerine çapraz bağlandığında ortaya çıkan ikincil bir immün olaydır. Aglütinasyona olanak veren özellik antikorların birden fazla bağlanma bölgelerinin olmasıdır (çift veya birden çok değerli). Eğer bir partikülün üzerinde birden fazla antijenik tanıma bölgesi mevcutsa, immün reaksiyonlar sonucu giderek büyüyen bir kafes oluşur ve bir süre sonra bu partiküller görülebilir büyüklüğe kadar erişir. Aglütinasyon reaksiyonlarını etkileyen başlıca faktörler arasında antikorların sınıfı, afinitesi, aviditesi, partiküller üzerindeki bağlanma bölgelerinin birbirine yakınlığı ve sayısı, antikorlar ile partiküllerin relatif konsantrasyonları arasındaki fark, elektrostatik etkileşimler (“zeta potansiyeli”) ve ortamın viskozitesi sayılabilir. IgM sınıfı antikorlar 10 adet antijen bağlama bölgeleri olması sebebiyle aglütinasyonda IgG tipi antikorlardan daha etkilidir ve en iyi “aglütininler” olarak kabul edilirler.

Aglütinasyon testleri incelenecek maddenin ortamda nativ (bağlanmamış) veya bir taşıyıcıya bağlı halde olması ile ilişkili olarak direkt ve indirekt olarak ikiye ayrılmaktadır. Taşıyıcı moleküller genellikle 0.05 mikrondan 7 mikrona kadar değişen çaplardadır. Bunlar,  kırmızı kan hücreleri, lateks partikülleri, lipozomlar, mikrokapsüller veya benzeri partiküller olabilir(181).

İmmünoassayde lateks partiküllerinin kullanımı ilk defa 1956 yılında Singer ve Plotz tarafından bildirilmiştir. Lateks partiküllerinin yüzeyi genellikle analizat ile aglütinasyon oluşturacak bir madde ile kaplanmıştır. Lateks kullanımı kırmızı kan hücreleri kullanıldığında gözlenen değişkenlikleri ortadan kaldırmıştır. Buna rağmen prozon olayı yine de anlamlı düzeyde olabilir. Kaplanmış mikrosferlerle klinik testler yaparken üreticilerin kullanım önerilerine mutlaka uyulmalıdır.

Turbidimetre ve benzeri bir teknik kullanan nefelometre klinik immünolojide tıbbi olarak son derece önemli birçok maddenin kantitasyonu amacıyla kullanmaktadır. Hata payı az, hızlı ve otomatize aletler olmaları avantaj sağlamaktadır. Bu tekniklerin koagülasyon laboratuarında kullanımı kısıtlıdır. Turbidimetre ve nefelometrenin temel prensibi solüsyon içindeki partiküllerin ışık saçılımıdır. Dikkatli kontrol edilen şartlarda bir immün kompleks oluştuğunda ışık saçılımı analizatın miktarı hakkında bilgi verebilir. Turbidimetrik tekniklerde immün kompleks ile etkileşen ışığın yoğunluğundaki azalma ölçülürken nefelometrik sistemde belli bir açı ile saçılan ışık yoğunluğu ölçülür. Nefelometre turbidimetreye nazaran küçük parçacıkların ölçümünde daha hassas iken, turbidimetre ile büyük kompleksler daha hassas belirlenebilmektedir .

Turbidimetre 1950’lerin başlarından beri, özellikle büyük immün komplekslerin tetkikinde kullanılan, kantitatif bir analiz yöntemidir. Bu teknikte partiküller içeren bir süspansiyonun ile etkileşen ışığın yoğunluğundaki değişiklikler bir spektrofotometre tarafından ölçülmektedir. Lateks partikül aglütinasyonu ve turbidimetrenin koagülasyon laboratuarında başlıca fibrin yıkım ürünlerinin (FDP) ve D-Dimer düzeylerinin  semikantitatif olarak saptanmasında kullanılmaktadır. Fibrin yıkım ürünleri (FDP), fibrinojen, fibrin monomerleri, fibrin polimerleri ve çapraz bağlı fibrinin plazmin tarafından parçalanmasıyla oluşur. D-dimer ise FXIIIa ile çapraz bağlanmış fibrinin plazmin ile parçalanması sonucu oluşur. Total FDP yerine çapraz bağlı degradasyon ürünlerinin (XDP) ölçülmesi fibrinolizin spesifik bir ölçütüdür. D-Dimer ölçmek için geliştirilmiş çoğu turbidimetrik testte, lateks partikülleri veya fibrin D-dimer veya fibrinin D fragmanına karşı geliştirilmiş spesifik monoklonal antikorlarla kaplı diğer mikropartiküller kullanılmaktadır. Bu antikorlar intakt fibrinojen ile reaksiyona girmezler. Bu nedenle tam insan plazması ile çalışmaya olanak sağlarlar. Yükselmiş D-dimer düzeyleri DİK, pulmoner emboli, arteryel ve venöz trombozda, septisemi, siroz, kanser, orak hücreli anemi ve cerrahi girişim sonrası görülebilir. Ancak, D-dimer genellikle sadece tromboembolik hastalıkların; özellikle derin ven trombozu ve pulmoner embolinin tanısında kullanılır. FDP ve XDP ise gebeliğin geç dönemlerinde ve cerrahi sonrası ilk 48 saatte yüksek bulunur. Fibrinolitik tedavi esnasında FDP pozitif bulunur ancak tromboliz olmadığı sürece D-dimer negatif kalır. D-dimer saptanmasında enzim immünoassay yöntemler de geliştirilmiştir. Ayrıca von Willebrand faktörü, serbest protein S ve diğer bazı proteinler için kullanılmak üzere turbidimetrik reaktifler de mevcuttur(182-185).

Nefelometrik teknikler spesifik bazı proteinlerin, ilaçların ve diğer maddelerin immünokimyasal ölçümünde başarı ile uygulanmıştır. Nefelometride bilinen bir miktar spesifik antikor ölçülmesi istenen antijeni içeren solüsyonun içine ilave edilir. Bu reaksiyonda oluşan büyük antijen-antikor komplekslerinin yarattığı ışık saçılımının yoğunluğu ölçülerek elde edilen sinyaller bir mikrokompütere gönderilir ve konsantrasyon birimine çevrilir. Nefelometre bazı klinik laboratuarlarda fibrinojen veya faktör VIII ilişkili antijenin kantitasyonunda kullanılmaktadır(181-185).

2.10.1.4. Enzim İmmünoassay

Enzim İmmünoassay (EIA), enzimler, koenzimler, fluorojenik substratlar ve enzim inhibitörlerinin işaretleyici olarak kullanıldığı  nonizotopik bir  immünoassaydir. EIA için olmazsa olmaz koşul bir antijen veya antikorun bir enzime bağlı olmasıdır. Ancak bu bağlanma sırasında antijen antikor kompleksinin immünolojik veya enzimatik aktivitelerinin bozulmaması gereklidir. Solid-faz EIA tekniklerinde antijen ya da antikor bir polistiren test tüpü, bir mikrotitre taşıyıcı (polistiren veya lateks yapısında mikropartiküller), agaroz, mıknatıslı boncuklar ya da başka bir fiziksel taşıyıcıya  bağlı olmalıdır. 186

İmmünoassay sistemlerde kullanılan enzimler de stabil olmalıdır. Bu enzimler saf halde bulunabilmeli, devir hızları yüksek olmalı ve test tüpü içinde bulunan diğer maddelerle etkileşimleri olmamalıdır. Ayrıca kullanılan enzimler substrat için spesifik olmalıdır. Son reaksiyon ürünü uygun yöntemlerle ve düşük konsantrasyonları da saptayabilecek şekilde ölçülebilmelidir. EIA’da  en sık kullanılan enzim yabanturpu peroksidaz  (HRP)’dir. HRP’nin substratı hidrojenperoksit (H2O2), ürünü de oksijendir. Reaksiyonda açığa çıkan oksijen indirgenmiş, renksiz bir kromojeni okside etmek için kullanılır (genellikle indirgenmiş ortofenilen diamin, OPD). Son ürün olan okside OPD kahverengidir. Çoğu EIA, işaretleyici olarak yabanturpu peroksidaz veya alkali fosfatazları kullanmaktadır. Bunlardan başka glukoz oksidaz, beta-D-galaktozidaz ve başka birçok enzim de bu teknik içinde denenmiştir. Fluorimetrik teknikler kullanılarak HRP, beta-D-galaktozidaz ve alkali fosfataz için elde edilen saptama alt sınır sırasıyla 5, 0.2 ve 10 attomol olarak bulunmuştur. EIA için pratik olarak saptama alt limitini 0.01-0.02 attomol/ligand olarak verebiliriz. Enzim immünoassay’ler arasında en sık kullanılan teknik, enzime bağlı immünosorbent assay ya da kısaltılmış adı ile ELISA’dır. 187

Enzim immünoassay, klinik laboratuarda antikor veya antijenlerden oluşan birçok analizatın ölçümünde kritik öneme sahip bir tekniktir. Hemostaz laboratuarında, enzim immünoassay pıhtılaşma faktörlerinin, fibrinolitik bileşenlerin ve düzenleyici proteinlerin antijenik düzeylerini saptamada kullanılır(186-187).

2.10.2.Trombofili testleri

2.10.2.1. Antitrombin III

Toplumda antitrombin eksikliği prevalansı, 1/2000 – 1/5000 arasında değişmektedir. Ailede erken yaşta başlayan tekrarlayıcı tromboz hikayesi vardır ve travma veya cerrahi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. AT eksikliği bulunan hastaların %70’inde tromboz 35 yaşından önce gelişir. 50 yaşına kadar hastaların % 85’i, bir veya diğer şekliyle tromboz ile karşılaşmıştır.

Semptomatik hastaların % 20’sinde arteryel tromboz da gözlenir. Oral kontraseptif kullanımı ve gebelik tromboz riskini artırmaktadır. Edinsel AT eksikliği, 3 gün veya daha fazla intravenöz heparin tedavisi almış hastalarda, karaciğer hastalığında, DİK, nefrotik sendrom varlığında ve L-asparaginaz tedavisi sonrasında görülebilir. Oral kontraseptif kullanımı, AT düzeylerinde %10-20 oranında bir düşüşe neden olur.

Konjenital ve edinsel AT eksiklikleri(trombinin majör inhibitörü) fonksiyonel ve amidolitik metotlar kullanılarak belirlenebilir. İlk basamak heparin varlığında hasta AT metot dizaynına bağlı olarak ya Faktör IIa veya faktör Xa ile nötralize edilir. Hasta AT düzeyi hız/oran sınırlayıcısıdır. Enzim AT ile inhibe olmadığı için, kromoforla(renk veren madde) bağlanan sentetik substratı ayırır. Bu nedenden dolayı kromojenik olarak isimlendirilir. Oluşan renk başlangıçdaki AT miktarı ile ters orantılıdır. Şekil 33’de kromojenik anti-faktör Xa assayi gösterilmektedir.

Piyasada bulunan birçok AT assayleri ya bovin trombin yada ekzojen olarak sağlanan enzim  bovin Xa kullanır. Bu iki enzimin seçimi stratejiktir. Human heparin kofaktör II(HCII) bovin trombin veya human FX ayı inhibe etmez. Human trombin kullanıldığında HCII AT’le birlikte ortaya çıkan enzimi inhibe eder ve AT seviyesini olduğundan fazla çıkar( hem AT ve HCII ile nötralize olan trombin daha az rezidüel trombin ayrılır ve daha az renk oluşumuna yol açar). HCII düzeyi tip 1 diyabetli hastalarda ve gebelikte yüksek bulunur. Teröpatik heparin bovin ve human trombin temeline dayanan AT metotlarını interfere eder fakat target enzim kullanan FXa’yı kullananları etkilemez(175, 188-189)

2.10.2.2. Protein C ve Protein S

Heterozigot protein C eksikliğinin prevalansı 200-300’de 1’dir; ancak bununla ilişkili trombozun toplumda 10.000’de 1’den daha az sıklıkta görüldüğü tahmin edilmektedir (trombotik hastalarda prevalans %2-5).  Tedavi edilmediğinde hayati tehlike yaratan trombozlara neden olan homozigot protein C eksikliği, tipik olarak doğumda ortaya çıkar. Heterozigot protein eksikliği olan hastalar ise genellikle 35 yaş öncesinde, bacak, mezenterik venler veya iliofemoral venlerde tromboz ile görülür. Olguların yaklaşık % 70’inde ilk trombotik atak spontan olarak gelişirken geri kalan kısmında başka trombotik risk faktörlerinin varlığı gösterilmiştir. Edinsel protein C eksikliği, karaciğer hastalığında, dissemine intravasküler koagülopatide (DİK), postoperatif durumlarda, erişkinlerde görülen solunum probleminde, nefritik sendromda ve L-asparaginaz tedavisi ile birlikte tanımlanmıştır. L-asparaginaz, bazı lösemilerin tedavisinde kullanılan bir ilaçtır.

Herediter protein S eksikliği, kalıtsal nedenli trombozların % 5-8’inden sorumludur. Bu hastalık tipik olarak bacaklarda derin ven trombozu olarak kendini gösterir; trombozların medyan  başlangıç zamanı, 20’li yaşların sonlarına dayanır. Sıklıkla ailede tromboz hikayesi vardır.  Etkilenen ailelerdeki kişilerin asemptomatik olabildiği protein C eksikliğinin aksine, protein S eksikliği olup da tromboz saptanmayan tek bir aile bireyi bildirilmemiştir. Edinsel protein S eksikliği; gebelikte, oral kontraseptif kullananlarda ve nefrotik sendromda görülebilir. Dolaşımdaki protein S’in yaklaşık % 60’ı, C4b bağlanma proteinine bağlı olarak bulunduğundan C4b  bağlanma proteini düzeylerindeki artışların fonksiyonel protein S seviyesinde bir düşüşe neden olduğu düşünülmektedir.

Protein C (PC) ve Protein S(PS) eksiklikleri venöz tromboz için risk faktörüdür. Bu  iki protein ile ilgili assaylar;

1.     Fonksiyonel

2.     İmmünolojik metotlar olarak iki kategoriye ayrılır.

İmmünolojik assayler kalıtsal PC ve PS eksikliklerinin doğrulanmasında ve sınıflandırılmasında kullanılır. Bundan dolayı bu bölümde sadece fonksiyonel testlerle ilgili analiz öncesi değişkenler anlatılacaktır.

APTT pıhtı bazlı PC ve PS için örnekler veya PT bazlı PS assayler %3.2’lik sodyumsitratlı tüplere alınmaktadır. Hem PT hemde APTT metotlarının dayanak noktası PC’dir. Yılan zehiri ile PC  aktive edilerek( ya eksojen olarak sağlanan PS asay yada hasta ile(PS assay)   FVa ve FVIII a inhibe edilir ve böylece pıhtılaşma zamanı uzar. Pıhtılaşma zamanı  çok uzamışsa PC ve PS aktiviteleri de çok büyük olur. Şekil 34’de APTT bazlı protein Cve protein S assayi gösterilmiştir.).

PT bazlı PS deneylerinde faktör VIIa’nin yükselmiş düzeyleri protein S aktivide değerlerini hatalı düşük çıkaracaktır ( kısalmış PT’yi taklit etmesi). Benzer biçimde APTT bazlı PC ve PS assayleri akut faz durumlarında protein aktiviteleri değerinin altında çıkar. Bunda faktör VIIIin > % 250’den yüksek düzeylerinin APTT pıhtılaşma zamanlarını kısaltmasıyla sonucudurlanır. İkinci akut faz rekatanı C4b bağlayıcı protein(C4BP), PS aktivite değerlerini ise çok güçlü bir şekilde tam aksi şekilde etkiler. Bu artıştan dolayı bu multimerik proteinler dolaşımdaki PS seviyesini düşürür.

PT ve APTT pıhtı bazlı metotların kullanıldığında, heparin veya direkt trombin inhibitörleri (DTIs) alan hastalarda, PC ve PS aktiviteleri beklenin üzerinde oluşabilir. APTT bazlı metotlar ise lupus antikoagülandan da etkilenir. Protein düzeyleri yalancı yüksek olduğu için, üç antikoagülan sınıfının ayrı ayrı pıhtılaşma zamanlarını uzatır. Bu yüzden daha fazla uzama tasarlanan metota bağlı olarak aktivite düzeylerinin yanlış olarak yükseltilmesiyle sonuçlanır. Birçok metotda heparin interferansını minimuma indirmek için reaktifin içinde heparin inhibitör içermelidir. Bu heparin nötralizerleri teröpatik heparin için efektif olmalıdır fakat ve heparin konsantrasyonu 1.0-2.0 IU/mlden büyük olmamalıdır. Kontaminasyon için bu miktar önerilmektedir.

APTT pıhtılaşmaya dayalı PC metotlarında warfarinle ilgili analiz öncesi önemli noktalar gösterilmemiştir halbuki amidolitik PC metotlar için bunu söyleyemeyiz

Kromojenik substratlara dayalı ölçümlerde; PC DTIs, heparin, faktör VIII yüksekliği ve lupus antikorlarından etkilenmesede; bu metodolojilerde; PC’nin hipokarboksile formlarının bulunması PC seviyelerinin beklenenden yüksek çıkmasına neden olabilir. Pıhtılaşmaya dayalı PC metotları kullanıldığında; PC nin bu formları hem in vivo hemde invitro olarak nonfonksiyone olmasında rağmen amidolitik aktivitesini yitirmemektedir. Kromojenik testlerden elde edilen PC değerleri APCRezistans bulunan hastalarda bu değerler normal bulunur. Çünkü FVIII ve FVa faktörlerini inhibe ettiği için bu metotlarda APC nin fizyolojik rolünü değiştirmez. Buna karşın APCR’nin fizyolojik farklılıkları pıhtılaşmaya dayalı metotlarda PC-PS’in fonksiyonel sonuçlarının beklenenin altında çıkmasına neden olabilir. Çünkü bu testler protrombinaz(FVa) ve Tenase(FVIIIa) kofaktörlerinin APC ile inhibisyonu üzerine dayanmaktadır. Antikoagülan proteinleri etkileyen diğer fizyolojik/endojen faktörler Tablo -29’de belirtilmektedir(175, 190-191).

Tablo-29. Antikoagülan Proteinleri Etkileyen Faktörler

 

Protein C

Protein S

Antitrombin

Heparin tedavisi

Normal

Normal

Düşük

Kumadin tedavisi

Düşük

Düşük

Normal

Gebelik

Yüksek

Düşük

Düşük

Yenidoğan

Düşük

Düşük

Düşük

Menapoz

Yüksek

Normal

Yüksek

Oral Kontraseptiv

Yüksek

Düşük

Yüksek

Hormon tedavileri

Yüksek

Düşük

Normal

Akut tromboz

Düşük

Düşük

Düşük

DIC

Düşük

Düşük

Düşük

Nefrotik sendrom

Yüksek

Düşük

Düşük

Karaciğer Hastalığı

Düşük

Düşük

Düşük

 

Normal: Yetişkin Normal,

Düşük: Düşük normal/ Normalin en düşük noktası,

Yüksek: Yüksek Normal/ Normalin en üst noktası

 

Veriler Ledford- Kramer, MR, The Clotting Times 2005; 5(1):2-9’dan alınmıştır.

2.10.2.3. Faktör V Leiden

Aktive protein C (APC), koagülasyon sisteminin başlıca düzenleyicisidir. Fosfolipide bağlı aktive  faktör VIII (VIIIa) ve aktive faktör V (Va)’i parçalayarak kanın pıhtılaşmasını inhibe eder. Günümüzde trombozun bilinen en sık kalıtsal nedeni olan faktör V Leiden, ilk defa Şubat 1993’te tanımlanmıştır.Toplumun % 5’inde görülen bu defekt, kalıtsal nedenli trombozların %20-50’sinden sorumludur. Amerika Birleşik Devletlerinde her yıl yaklaşık 50000 kişi bu defekt nedeniyle ölmektedir.  Tromboz gelişme riski, heterozigot hastalarda normal popülasyona göre 5-10 kat, homozigotlarda ise 50-100 kat daha fazladır. Östrojen veya oral kontraseptif kullanımı, bu riski daha da artırmaktadır. Olguların %90-95’inde APCR, faktör V geninde meydana gelen  ve otozomal dominant olarak kalıtılan bir tek nokta mutasyonudur. Bu mutasyon neticesinde aktive faktör V (Va), APC inaktivasyonuna dirençli hale gelir (aktive protein C rezistansı- APCR). APCR’nin geri kalan %5-10’luk kısmını faktör V geninde meydana gelen diğer genetik değişiklikler oluşturmaktadır.

Faktör V geninde( faktör V Leiden)  bir mutasyon sonucu oluşan Aktive protein C  rezistansı  venöz tromboz riskini gösteren bir testtir. APCR için fonksiyonel testler iki başlık altında incelenebilir.

Birinci generasyon kitleri APCR fenotipini nerdeyse ikinci generasyon assayleri gibi belirlerlerken ikinci generasyon assaylerinin duyarlılığı nerdeyse % 100 tür ve APCR fenotipinin en çok rastlanan nedeni olan faktör V Leiden için spesifiktir, İkinci generasyon deneylerinde; FV deficient plazma ile hasta plazması dilue edilerek heparin, warfarin, faktör eksiklikleri ve lupus antikorları ile interferans önlenmiştir. Bununla beraber ikinci generasyon testlerinde hala çok kuvvetli LA pozitifliğinde interferans  olabilir(192-193).

Aktive protein C rezistansı  (APCR) için kullanılan hızlı tarama testi de yaygın kullanılan bir aPTT modifikasyonudur. 1993’te Dahlback ve arkadaşları aktive protein C’nin Va’yı inaktive edememesiyle sonuçlanan mutant bir faktör V (faktör V Leiden) buldular. Protein C yolundaki bu defekt tromboembolik hastalık riskinde ciddi bir artış ile karakterizedir. APCR’nin laboratuar tanısı hızlı tarama testi ile başlar ve eğer tarama pozitif ise moleküler testlerle doğrulama gereklidir. Dahlback’in orijinal aPTT temelli tarama testinden modifiye edilen günümüzdeki tarama testinde hasta plazması önce faktör V içermeyen bir plazma ile dilüe edilir(şekil 35). Bu dilüsyonun amacı, hasta plazmasını terapötik heparin konsantrasyonlarından temizlemek, koagülasyon faktör eksiklikleri varsa düzeltmek ve olabilecek bazı lupus inhibitörlerinin etkisini ortadan kaldırmaktır.  Daha sonra ortama ekzojen aktive protein C (APC) eklemeden ve ekleyerek aPTT çalışmaları yapılır. Normal kişilerde ortama eklenen APC aPTT’yi anlamlı şekilde uzatırken APCR olan hastalarda belirgin uzama görülmez. Sonuçlar genellikle APC eklenmiş aPTT/ APC eklenmemiş aPTT oranları olarak bildirilir. Bu modifiye tarama testi Faktör V Leiden mutasyonun varlığını duyarlı bir şekilde gösterdiği gibi diğer faktör V mutasyonlarının varlığına yönelik de bilgi vericidir. Hatta homozigot, heterozigot ayırımı yapabilir ve tedavi edici düzeylerde heparin veya warfarin  kullanımından etkilenmez(175) .

2.10.2.4. Protrombin Fragment 1+2(F1.2)

F1.2 protrombinin FXa ile ayrılmasından sonra oluşan aktivasyon peptittir. Trombin generasyonu için biyolojik marker olduğu için hiperkoagülobil durumların saptanmasında, oral antikoagülan tedavinin etkinliğinin izlenmesinde veya trombotik risklerin değerlendirilmesinde yardımcıdır. F1.2 kantitatif olarak sadece ELİSA yöntemiyle tayin edilmektedir (şekil 36)(175,194).

Bu test koagülasyon aktivasyonuna çok duyarlı olduğu için kan alma sırasında çok dikkatli olunmalıdır. Üstelik çeşitli otoriteler antikoagülan seçiminin bu deneyi etkilediğini göstermişlerdir. Sodyum sitrat antikoagülan önerilmesine rağmen heparin veya PPACK(nedir) kan alınan tüpde devam eden trombin oluşumunu daha azaltabilir. Plazmada dolaşan  F1.2 protrombinden 1000 kat daha düşük olduğundan protrombinin çok küçük aktivasyonu bile F1.2 seviyelerini hatalı yüksek çıkmasına neden olur

2.10.2.5. Lupus Antikoagülanı/Antifosfolipid Antikor Sendromu

Lupus antikoagülanları fosfolipidlere bağlı proteinlere karşı gelişmiş antikorlardır; pıhtılaşma testleri ile etkileşerek testlerde uzamaya neden olurlar. Bir başka benzer  durum antifosfolipid  antikorları (antikardiyolipin antikorları) ile oluşur. Lupus antikoagülanlar, PTT başta olmak üzere  fosfolipide bağlı pıhtılaşma testleri ile etkileşime girerler. Bazen hem PTT  hem de PT uzar, tek başına PT’nin etkilenmesi ise son derece nadirdir. Lupus antikoagülan terimi, bu antikorların ilk defa sistemik lupus eritematozus ve koagülopatisi olan iki kadında tanımlanmasından kaynaklanmaktadır. Lupus antikoagülanlar, lupusu olmayan hastalarda da görülebileceği ve olguların çoğunda kanama riski olmadığı bilinmektedir. Aksine lupus antikoagülanı varlığında tromboz riskinde anlamlı bir artış olur. Alt ekstremite derin venlerinde, arterlerde, serebral damarlarda ve mezenterik, portal veya hepatik venler gibi alışılmadık lokalizasyonlarda  tromboz görülmesi lupus antikoagülanını akla getirmelidir(195-198).

Lupus antikoagülanlar, antifosfolipid antikorların bir alt grubu olarak kabul edilmektedir. Antifosfolipid antikorların hepsi fosfolipide bağlı testlerle etkileşmez; etkileşenler lupus antikoagülan olarak adlandırılır. Antifosfolipid antikorlar, genellikle ELISA gibi immünolojik yöntemlerle saptanır. Lupus antikoagülanlar ise Russell viper venom zamanı v.b. gibi pıhtılaşma esasına dayalı testlerle tespit edilir. Lupus antikoagülanı olan hastaların tamamına yakınında (> % 90) antifosfolipid antikorlar pozitif buluınur; ancak antifosfolipid antikoru müspet hastaların çoğunda lupus antikoagülana rastlanmaz. Antifosfolipid antikorların titresi ile lupus antikoagülanın şiddeti arasında iyi bir korelasyon yoktur (örneğin hastanın ELISA ile düşük titrede antifosfolipid antikoru saptanmasına karşın PTT’de  ciddi uzama görülebilir). Antifosfolipid antikorlar, adında ifade edilenin tersine fosfolipide değil fosfolipid üzerinde yer alan bir proteine karşı gelişmektedirler. En sık b2-glikoprotein I’e (diğer adıyla apolipoprotein H)  karşı antikorlar görülse de protrombin, protein C veya S ve diğer proteinlere karşı antikorlara da rastlanır.

Lupus antikoagülan/antifosfolipid antikorlar lupusta (yanlış pozitif VDRL testi olan hastalar), diğer otoimmün hastalıklarda, birçok infeksiyonda, bazı ilaçlarla (kinidin ve prokainamid gibi antiaritmik ilaçlar, fenotiyazinler gibi psikiatrik ilaçlar) HIV infeksiyonunda ve idyopatik olarak  görülebilir.

Lupus antikoagülanlı hastalarda kanama nadiren görülür, ancak bazı hastalarda lupus antikoagülana düşük protrombin seviyeleri eşlik eder. Bu hastalarda kanama sorun olabilir ama genelde tromboz her zaman daha büyük bir risktir.  Çoğu olguda lupus antikoagülanı preoperatif  yapılan tetkiklerde istenen PTT’nin uzamış bulunmasıyla saptanır (Bu durumda koagülopatinin nedeni açıklığa kavuşuncaya dek cerrahi girişim ertelenmelidir).

Antifosfolipid antikor (antiphospholipid antibody [APA])  sendromunda lupus antikoagülanına veya orta/yüksek titreli antifosfolipid antikorlarına eşlik eden venöz ve/veya arteryel tromboz, serebrovasküler olaylar (geçici iskemik atak, inme, amurozis fugaks, v.b.) trombositopeni, tekrarlayan düşükler, kalp kapakçık anomalileri (mitral kapak başta olmak üzere kapakçıklar üzerinde nonbakteriyel vejetasyonlar) ve livedo retikülaris görülebilir.

İlaca veya infeksiyona bağlı lupus antikoagülanı gelişenlerde tromboz riskinin düşük olduğuna inanılsa da bu tam olarak doğru değildir. Ancak lupus antikoagülanı saptanan bir çok hastada tromboz gelişmediği de unutulmamalıdır.

Lupus antikoagülanını saptamak için kullanılan testler arasında  PTT, dilüe PTT, dilüe Russell viper venom zamanı, kaolin pıhtılaşma zamanı sayılabilir. Antikorun fosfolipid ile ilişkili olduğunu doğrulamak için kullanılan  birçok test vardır, bunlardan biri de trombosit nötralizasyon işlemidir (platelet neutralization procedure ([PNP]). Bu yöntemde antikoru doyuracak şekilde eksojen bir fosfolipid (örneğin trombosit membran fosfolipid reaktanı) hasta plazmasına eklenir. Plazma fosfolipid karışımının sonucu, daha sonra normal plazma ve salin karışımından oluşan bir kontrolle karşılaştırılır. Eğer plazma fosfolipid karışımı, pıhtılaşma testini kısaltıyorsa lupus antikoagülan mevcut demektir. Kullanılan test PTT ise hastada normale nazaran 6 saniyeden daha fazla kısalma gözlenmelidir(55,175,195-198).

2.10.2.5.1.Lupus Antikoagülan Testleri

            Trombotik hastalıklar ve tekrarlayan spontane çocuk düşüren  hastaların değerlendirilmelerinde, lupusantikoagülanı varlığında duyarlı ve doğruyu ortaya çıkarma çok önemlidir. Lupus antikoagülanı tayin eden yöntemler tombositlere  oldukça duyarlıdır. Hastanın plazmasında bulunan antifosfolipit antikorlarının aktivitesi trombositlerdeki fosfolipitler ile nötralizasyonu sonucu hatalı negatif sonuçlar oluşabilir. Bundan dolayı NCCLS’nin santrifügasyon kılavuzlarına uyma lupus antikoagülan testlerinde çok önemlidir.

Lupus antikoagülan testlerinin bir çoğunda sitratlı plazma ve trombositten fakir plazmanın birlikte olması  çok önemlidir. Analiz öncesi önemli noktaları 2 şekilde merkezleştirebiliriz.

  • Örnek toplanan tüpden plazma çıkarılırken  buffy coat kısmı dağıtılmadan düzgün bir şekilde çıkarılmalıdır
  • Santrifügasyon uygun şekilde yapılmalıdır.

LA deneyleride; bozulmamış ve fragmente olmuş trombosit membranından türeyen prokoagulant fosfolipitlerin etkilerini minimuma indirme mantığı pıhtılaşma zamanları için de olabilir. Trombositten fakir plazmada(PPP) fosfolipitlerin bulunması gerçek testi yapmadan önce örnek tüpünde  trombosit nötralizasyonuna neden olacağından tarama testlerinin yanlış negatif çıkmasına neden olacaktır.

NCCLS H21-A4, 2003, İSTH standartizasyon komitesinin lupus antikoagülan / antifosfolipt antibody subkomitesi PPP tanımına açıklık getirerek; plazmada reziduel trombosit sayısının 10x109/Lden daha düşük olmasını önermektedir. PPP toplanması için bu kriterlere göre örnekler 1.500 g’de  en az 15 dakikadan  santrifüj edilerek hazırlanmalıdır. PPPda rezidüel trombosit sayısı otomatik hücre sayıcısı kullanılarak kolaylıkla doğrulanabilir. Çeşitli LA testlerinde her yerde bulunan normal pool plazma miksing çalışmalarında kullanıldığı için  normal pool plazma önerilen reziduel rombosit sayısını da karşılamalıdır.

Plazmadan reziduel trombositleri tamamen elimine etmek için veya azaltmak için değişik prosedürler kullanılmaktadır. Bunlar;

·       PPP’nın filtrasyonu(ya test yapılmadan veya dondurulmadan önce taze plazmada yada dondurulmuş plazmayı çözdükten sonra 0.22 u filtre kullanılarak

·       Plazmanın ultrasantrifügasyonu( 10000 g den daha büyük hızlarda santrifüj)

·       Trombositten fakir plazma elde etmek için hazırlanan PPP’nın ultrasantrifügasyonu ve filtrasyonuyla yapılır.

Bu metotlarla trombositten fakir plazma elde etmek için veya PPP kullanarak LA tayinlerinde sensitiviteyi arttırdığı birçok çalışmalarla gösterilmişdir. Ancak büyük moleküller filtrasyon işleminde uzaklaştırılabilidiği için vonWillebrand faktör çalışmaları gibi diğer testlerde  bunları uygulamakdan kaçınılmalıdır. Ultrasantrifügasyon uygun yapılmazsa( cihazı dudurmak için  fren uygulanması) trombosit fragmentasyonuna neden olacağından  örnek yanıltıcı olarak daha düşük sonuç verir(175). LA testlerinin birçoğu aşağıdaki metotlara dayanmaktadır.

1.     Protrombin zamanı

2.     APTT veya

3.     DRVVT(yılan zehiri ile FX’nun aktivasyonuyla genel pathwayın değerlendirilmesiyle yapılır. Warfarin veya heparin gibi endojen ajanlar ve  direkt trombin inhibitörleri bu testleri tersine etkilediği için pıhtılaşma zamanları hatalı uzun çıkar.

2.10.2.5.1.1. Dilüe Russell Viper Venom Testi (dRVVT)

dRVVT lupus antikoagülanı (LA) adı verilen antifosfolipid sendromlu hastalarda görülen bir antikor varlığını saptamak için kullanılır. LA’lar IgG ve IgM yapısında antikorlar olup aniyonik fosfolipidlerle ilişkiye girerek fosfolipide bağlı aPTT ve dRVVT gibi pıhtılaşma testlerinin süresini uzatmaktadır . dRVVT LA için aPTT’den daha spesifiktir çünkü kontakt veya intrinsik yolda yer alan faktörlerden veya faktör VIII, IX veya XI’e karşı gelişmiş inhibitörlerden etkilenmez. Russell viper venom (RVV) içindeki koagülan protein kalsiyum varlığında faktör X’u intrinsik ve ekstrinsik yolları baypas edip direkt olarak aktive eden bir serin  proteazdır. Aktive faktör X faktör II’yi (protrombin) faktör V ve fosfolipid varlığında aktive eder. Dilüe Russell Viper Venom zamanı testinde (dRVVT) ise fosfolipid dilüe edilerek pıhtılaşma zamanı fosfolipid yüzey varlığını bloke edebilen maddelere karşı hassas hale getirilmektedir. DVVtest ticari olarak satılan ve dRVVT’yi standartize etmek için geliştirilmiş bir reaktiftir. Benzeri reaktifler Dade-Behring, (Marburg, Almanya) Precision Biologic (Dartmouth, Nova Scotia) ve diğer satıcı firmalardan elde edilebilir. DVVtest reaktifi içinde RVV, bitki fosfolipidi ve kalsiyum bulunmaktadır. İkinci bir ayraç olan DVVconfirm doğrulama reaktifi RVV, ekstra bitki fosfolipidi ve kalsiyum içerir. DVVconfirm içindeki ekstra bitki fosfolipidi uzamış DVV testinin (LA’yı saf dışı bırakarak) düzeltilebilir olup olmadığının görülmesi amacıyla hazırlanmıştır. Uzamış dRVVT bulunması, bir hastada lupus antikoagülan varlığını düşündürür ancak bunun doğrulanması gereklidir. Eğer uzamış dRVVT, normal ve trombosit plazması ile yapılan karışımlarda düzelmiyor ise, ancak fosfolipid sağlamak amacıyla eklenen trombositlerle düzeliyorsa tanı doğrulanmıştır. DVVtest ve DVVconfirm kullanıldığında eğer DVVtest/DVVconfirm oranı >1.2 ise LA varlığı için doğrulayıcıdır(55,199-200).

2.10.2.6. vonWillebrand Hastalığı

VWD, otomozal dominant geçiş gösteren; konjenital hemostaz bozukluğudur. Platelet adezyonunda rol alan bir protein olan VWF’un eksikliği ile karakterizedir. Trombositler  ve vWF , glycoprotein Ib reseptörlerini kullanarak subendotele  tutunur. Trombosit agregasyonu ise fibrinojen ve glycoprotein IIb-IIIa aracılığı ile olduğu için; VWD’de adezyon bozukluğu olmasına rağmen, agregasyon normaldir.VWF megakaryosit ve endotel hücrelerinden salgılanıp; adezyonda rol alırken; FVIII’in stabilitesi içinde gerekelidir. Bu nedenle FVIII düzeyleri (koagulasyon defekti olmaması açısından) VWD’da önemlidir(50, 201-204). En sık rastlanan tip; tip I olup %80’nı oluşturur (Tablo 30)(50).

Tablo 30. Vonwillebrand Hastalığı Tipleri

 

Kanama

zamanı

Faktor VIII

aktivitesi

VWF

aktivitesi

VWF:Rİ.Co

aktivitesi

Multimer

 

TipI 

Uzun

Düşük/N

Düşük

Düşük/N

N

 

TipIIa

Uzun

Düşük/N

Düşük

0

Abnormal

 

TipIIb

Uzun

Düşük/N

Düşük

Düşük/N

Abnormal

 

TipIII

Uzun

0

Düşük

0

Abnormal

 

 

 

 

 

 

 

 

von Willebrand hastalığı en sık rastlanan kalıtsal primer hemostaz bozukluğudur.vWH mutasyonlarının toplumdaki sıklığı %1–2’ye kadar çıkabilir, ancak pek çoğuna hiçbir zaman tanı konmaz. vWH’nin klinik ve laboratuar bulguları son derece heterojen bir görünüm sergiler; tanı koymak bu nedenle bazen çok güçtür.

vWH’nin üç alt tipi tanımlanmıştır:

·        Tip 1: En sık görülen tiptir (klinik vWH olgularının ³70’i). Plazma vWF düzeyleri düşüktür ancak yüksek moleküler ağırlıklı multimerler dahil her boyuttan multimer plazmada mevcuttur (kantitatif eksiklik). Otozomal dominant kalıtım paterni gösterir.

·        Tip 2: Tip 2 vWH’de kalitatif bir bozukluk söz konusudur, sayısal eksiklik yoktur. Tip 2 vWH’nin pek çok alttipi tanımlanmıştır. Çoğunlukla otozomal dominant kalıtılırlar; ancak otozomal resesif kalıtım gösteren nadir bazı alt tipler de vardır.

·        Tip 2A: Tip 2A’da yüksek moleküler ağırlıklı vWF multimerleri plazmada eksiktir, ancak toplam vWF düzeyi normaldir. En sık rastlanan tip 2 varyantı bu hastalıktır.

·        Tip 2B: Tip 2B’de vWF’in trombositler üzerinde bulunan vWF reseptörüne (GP Ib-IX/V) karşı afinitesi artmıştır; buna bağlı olarak çok  sayıda vWF trombositlerin yüzeyine bağlanır. Plazma düzeyi düşen vWF subendotelyal kolajene bağlanamaz. Diğer vWH tiplerinin tersine tip 2B vWH’de ristosetine aglütinasyon  yanıtı artmıştır. Hafif trombositopeni sıklıkla eşlik eder.

·        Tip 2M: Tip 2M vWH’de proteinin işlevselliği ile ilgili önemli bölümlerini ilgilendiren bir mutasyon vardır (‘M’ mutasyondan gelir). Proteinin çeşitli bölgelerinde farklı mutasyonlar tanımlanmıştır.

·        Tip 2N (vWH Normandy): Tip 2N’de vWF üzerinde FVIII’in bağlanma yeri eksiktir; bu nedenle vWF, FVIII için bir şaperon (bağlayıcı) görevi göremez. Sonuç olarak FVIII’in yarı ömrü kısalır ve plazma düzeyi düşer. Bu hastaların kliniği hafif hemofili A’ya benzer. Hemofili kliniği olan ancak aile hikayesi X’e bağlı resesif geçişle uyumlu olmayan hastalarda tip 2N von Willebrand hastalığından şüphelenilmelidir. VWF’in FVIII’e azalmış afinitesinin gösterilmesiyle tanı konur.

·        Tip 3: Tip 3 vWH’de plazmada  vWF tamamen veya tama yakın eksiktir. Bu olgularda da FVIII düzeyleri belirgin olarak azalmıştır (şaperon olarak vWF eksik olduğundan FVIII düzeyi de azalır). Hastalığın kliniği daha çok hemofiliyi andırır. Kalıtım şekli otozomal resesiftir. Tip 3 vWH nadirdir.

vWH’nin bu sınıflaması basit ve nispeten yeni bir sınıflamadır. Eski kitap ve makalelerde daha farklı ve çok sayıda alt tipin yer aldığı karmaşık sınıflama kullanılır (Tip IID, IIE vs). Yeni sınıflamada bu alt tiplerin çoğu tip 2A  kategorisinde toplanmıştır. Tip 1, 2B ve 3 yeni ve eski sınıflamada aşağı yukarı aynıdır.

    Hem kadın hem erkek cinste aynı sıklıkta rastlanır. Çoğunlukla ılımlı kanama diatezi söz konusudur. Daha çok mukozal( epistasis, dişeti, menoraji) kanama görülür. Ancak bazı olgular diş çekimi yada cerrahi sonrası devam eden kanamalar nedeniyle de saptanabilir. VWD nadir ağır klinik kanama episodları örneğin hemartozlar gösterir. Aspirin ile kanama eğilimi artar. Laboratuar bulguarı:

  • Trombosit  sayısı ve morfolojisi normaldir..
  • Kanama zamanı hemen her zaman uzundur.
  • VWF düzeyleri düşük olup, VWF: Ri.Co yüksektir. (VWF: Ri.C → trombosit adezyonundaki VWF’in fonksiyonundaki bozukluğu daha belirgin olarak gösterir.)
  • FVIII antijen düzeyleri de genellikle düşüktür. %25’in altında olduğunda APTT uzunluğuda saptanır. Trombosit fonksiyon testlerinde → trombosit adezyon testleri bozuk; aggregasyon testleri normaldir.

Kanama zamanının uzun olması nedeniyle; trombosit fonksiyon bozukluğu oluşturan konjenital patolojilerden (Glanzmann’s trombastenisi; Bernard Soulier Sendromundan) ayırt edilmelidir. Akkiz olarak  aspirin gibi ilaç kullanımı, myeloproliferatif hastalıklarda da kanama zamanı uzundur. Ancak VWD’de VWF eksikliğinin saptanması ayırt edicidir(50,201-204).

2.10.2.6.1. von Willebrand Hastalığının Laboratuar Tanısı

vWH tanısı için elzem olan tetkikler kanama zamanı, ristosetin ko-faktör, kantitatif  vWF ölçümü (ELISA veya Laurell roket immünoelektroforezi), ristosetin ile trombosit aggregasyonu ve  agaroz  jel elektroforezi yöntemiyle yüksek molekül ağırlıklı multimerlerin varlığının araştırılması olarak özetlenebilir. Bu testlerin hepsine her zaman gereksinim duyulmayabilir(50,175).

·        von Willebrand faktör düzeyleri aynı bireyde zaman içinde değişkenlikler gösterebilir. Östrojenin, stresin ve karaciğer hastalıklarının vWF düzeyini arttırdığı bilinmektedir. Gebelik döneminde de hem vWF’nin  hem de FVIII’in düzeyinde dramatik artışlar görülür. vWH tanısından kuvvetle şüphe ediliyorsa ama vWF düzeyi normal bulunmuşsa mutlaka bir süre sonra testler tekrar edilmelidir. Şüphelenilen hasta gebe bir kadınsa, vWF düzeyinin düşmesine zaman tanıyarak doğumdan haftalar sonra tekrar etmekte yarar vardır.

·        von Willebrand faktör düzeyleri kan grubuna göre değişkenlik gösterebilir. Kan grubu  ‘O’ olanlarda vWF düşük  ‘A’, ‘B’ veya  ‘AB’ olanlarda yüksektir. ‘O’ gruplu hastalarda vWH tanısını her zaman biraz şüphe ile karşılamak yerinde olur.

Tip 1 vWH’de KZ genellikle uzundur. Azalmış FVIII konsantrasyonuna bağlı olarak PTT hafif uzamış olabilir. vWF     multimerlerin şeklinde bozukluk yoktur ancak mutlak düzeyi azalmıştır (yüksek molekül ağırlıklı multimerler mevcuttur ama tüm multimerlerin konsantrasyonu düşüktür). Ristosetinle trombosit aggregasyonu ve ristosetin kofaktör aktivitesi azalmıştır. Diğer uyaranlarla trombosit aggregasyonları normaldir. vWH tanılı hastaların trombositleri üzerine normal plazma eklenmesiyle aggregasyon testi normale döner, bu da eksikliğin trombositlerde değil, plazmada olduğunu doğrular.

  • Tip 2A tanısı agaroz jel elektroforezde yüksek molekül ağırlıklı multimerlerin gösterilememesi ile konur. vWF mutlak düzeyi genellikle normaldir.
  • Tip 2B’de ristosetine artmış trombosit aglütinasyon yanıtı vardır. Tip 2B’li hastaların plazmaları normal insanlarda aglütinasyona yol açmayacak kadar düşük miktarda ristosetinle bile aglütinasyon yaratırlar.vWF mutlak düzeyi düşük bulunur ve agaroz jel elektroforezinde yüksek molekül ağırlıklı multimerlerin ( büyük çoğunluğunun trombositlere bağlanmış olması nedeniyle) azalmış olduğu görülür. Hafif trombositemi sıktır.
  • Tip 2M tanısı, sofistike tekniklerin varlığını gerektirir. Her laboratuvarda kolaylıkla yapılamaz. Tip 2N tanısı için ise öncelikle anamnez (hafif veya orta dereceli hemofiliyi andırır) ve kalıtım şeklinden (otozomal) yola çıkılmalıdır. Kesin tanı için vWF’ün FVIII’e afinitesini ölçen testlere gereksinim vardır (ancak bu konuda çalışan merkezlerde mevcut).
  • Tip 3’te plazmada vWF tamamen veya neredeyse tamamen yoktur.

2.10.2.6.2. von Willebrand Hastalığının Tedavisi

Tip 1 vWH olgularının çoğu, endotelden vWF salınımını sağlayan  desmopressin asetat (DDAVP) ile başarılı bir şekilde tedavi edilebilir. Desmopressin asetat ucuz ve güvenilir bir tedavi yöntemidir. Ayrıca infeksiyon riski yoktur. İlaç intravenöz veya intranazal yolla uygulanabilir. İntranazal yolun avantajı, hastaların tedaviyi hastaneye gelmeksizin evde kendi kendilerine yapabilmeleridir.Tip 2B vWH’de desmopressin asetat kullanımı, trombositopeniye neden olabileceği içinönerilmemektedir.

Biri diabetes insipidus diğeri de vWH’de kullanılmak üzere tasarlanmış iki ayrı DDAVP nazal sprey formu vardır.  vWH’de önerilen preparat, diabetes insipidusda kullanılandan 10 kat daha konsantredir, bu nedenle hastaların doğru preparatı kullandıklarından emin olunmalıdır.

Diğer vWH tiplerinde veya tip 1 vWH’li bir hastaya majör cerrahi girişim planlandığında faktör replasman tedavisi gerekir. Ticari olarak satılan saf vWF konsantresi yoktur ama bazı F VIII preparatları yeterli oranda vWF içerirler. vWF içerdiği söylenen her FVIII preparatında gerekli oranlarda vWF, özellikle de hemostaz açısından önemli olan yüksek molekül ağırlıklı multimerler bulunmayabilir. Humate-P, vWF’ü normal dağılımına benzer şekilde içerdiğinden en çok önerilen  preparat olmuştur. Ancak başka ticari formlarda da yeterli miktarlarda vWF bulunabilir, bu nedenle kullanmadan önce preparatların içeriği araştırılmalıdır.

            Rekombinan F VIII içinde vWF bulunmaz, bu sebeple vWH’lı hastalarda kullanımı önerilmez.

 
 

VWH’li hastalarda eskiden yüksek oranlarda vWF/FVIII kompleksi içeren kriyopresipitatlar kullanılırdı. Ancak kriyopresipitatların faktör VIII konsantreleri gibi sterilize edilememesi kullanımlarını sınırlamıştır. Günümüzde FVIII konsantreleri vWH tedavisinde kriyopresipitatların yerini almıştır(1,55).

2.10.2.6.3.Vonwillebrand Hastalığı Deneyleri

von Willebrand hastalık/ vonvillebrand faktör deneyleri 3 kategoriye ayrılabilir.

  1. Tarama prosedürleri(PT, APTT , trombosit sayısı ve PFA kapanma zamanı)
  2. Doğrulama testleri( Faktör VIII aktivitesi(FVIII:C), vWF antijen(vW:Ag) ve ristosetin kofaktör aktivitesi(VW;RCo)
  3. Farklı merkezlere gönderilen deneyler (RIBA(ristocetinle indüklenmiş trombosit aggregasyonu), VWF multimer analizleri, FVIII bağlama kapasitesi(VWF:FVIIIB) ve VWF-kollajen bağlama kapasitesi(VWF:CB).

Doğrulama testleri VWD testlerinin en uğraştırcı testleridir ve otomasyon ve ticari kitleri bulunduğundan dolayı özel uzmanlık alanından rutin laboratuarlara geçişi olmuştur.

FVII’in değişkenliğinin bilinmesi çok önemlidir bu nedenle örneklerin transportu, çalışılması ve depolanmasına bağlı olduğu için çok dikkatli edilmesi gerektiği NCCLS kılavuzlarında belirtilmiştir. Protein yapısal analizleri(VWF multimer analizleri) olduğu kadar VWF fonksiyonel testlerine de( VWF:RCo) ve VWF:CB) bu aynı kılavuzlar uygulandığında yeniden değerlendirilmesinin gerekli olması ilginçtir. Favaloro ve arkadaşları örneklerin tam kan olarak ve buzdolabında 3-6 saat muhafaza edildikten sonra çalışılan örneklerde(Bu NCCLS kılavuzlarının H21-A44) dışında olduğu için) ve  hemen test edilen örneklerde veya buzdolabında bekletilen plazma örneklerdeki değişikliklerin diagnostik olarak analamlı olduğunu göstermişlerdir. Yakın zamanlarda Lloyd ve arkadaşları ve Farugia ve arkadaşları bu gözlemleri desteklemişlerdir. Bu çalışmalarda örneklerin düşük ısılarda depolanan örneklerde VWF fonksiyonlarının kaybolduğunu kaydetmişlerdir. Favaloro VWFün ADAMTS13(VWF bölen proteaz) aktivitesinden çok etkilendiği için tam kan örneklerinin EDTAda toplanmasını ve 4 C’de depolandığında aktivitesinin azalmadığını göstermişlerdir. EDTA’nın, ADAMTS 13 aktivitesini inhibe eden bulgular birbirine uyumludur(1,50,55,175,201,202).

VWF antijen için immünolojik tayinler yukarıda bahsedilen analiz öncesi faktörlerden etkilenmemektedir. Kantitatif VWF protein için çoğunlukla kullanılan metot ELİSA ve lateks immünoassaydir(LIA). Römatoid faktör LIA metodunu interfere eder ve VWF:Ag nin beklenenin üzerinde çıkmasına neden olabilir. Diğer tarafdan lipemik ve bulanık örnekler bu metot kullanıldığında antijen seviyelerinin beklenenin altında çıkmasına yol açar. Ancak bu faktörler ultrasantrifügasyonla elimine edilebilir.

VWF’ün dolaşımdaki düzeyleri kan grupları ile ilişkili olduğu  çok iyi kanıtlanmıştır.(AB>B>A>O, AB en yüksek, O en düşüktür. Federici ve arkadaşları, VWF ün karbonhidrat bileşeni onu proteolitik yıkımdan koruduğunu göstermişlerdir. Bowen 2003 yılında bu konsepti genişletmiştir ve VWF üstündeki kan grup şekerlerinin ADAMTS 13 yoluyla onun proteolizini etkilediğini göstermişlerdir. ADAMTS 13’e VWF ün duyarlılığının O≥B>A≥AB için azaldığını göstermişlerdir( O en duyarlı, AB ise az duyarlıdır. Onun bu çalışmaları VWF’ ün dolaşımdan nasıl temizlendiğini, niçin O grubunda VWF:Ag düzeylerinin en düşük olduğunu ve VWF testlerinin bu  fizyolojik faktörlerden nasıl etkilediğini aydınlatmaya yardım eder(201,202).

VWF bir akut faz reaktanıdır. Bundan dolayı egserzis, yoğun stres durumlarından sonra VWF düzeylerini  yükseltir ve gebelik sırasında yükselir. VWF’ü etkileyen hastalık durumları fonksiyonel ve yapısal assayleri etkileyen( VWF multimer analiz mettolar) durumlar tablo 31’de listelenmiştir. Bu durumlarla birlikte, multimerik protein yapılarının fenotipik olarak benzemesi nedeniyle VWD’in kalitsal formları görülmüştür. Üstelik VWF için değişik örnek toplama şekillerinde ADAMTS13’e karşı sensitivitenin arttığı gösterilebilir. VWF multimer testleri için kan örneklerinin EDTA’lı tüplerde toplanması daha iyi olmasına rağmen  EDTA bulunan örneklerde proteazlar tamamen inaktive olmaz. (Dr Jingin kendi deneyimleri)(175).

Tablo 31. VWF Multimer Analizlerini Etkileyen Fizyolojik Faktörler

Patogenik mekanizma

Hastalıklar

 

İmmün kompleks oluşturan spesifik ve nonspesfik otoantikorlar VWF klirensini arttırması

Lenfoproliferatif Hastalıklar,

Neoplastik Hastalıklar,

İmmünolojik Hastalıklar

Malign veya diğer hüsresel yüzeyler üzerine

VWF’ ün absorbsiyonu

Lenfoproliferatif Hastalıklar,

Neoplastik Hastalıklar,

Myeloproliferatif Hastalıklar

VWF proteolitik yıkımının artması

Myeloproliferatif Hastalıklar,

Artmış Shear Stres,

Üremi,

Fibrinolitik Tedavi,

Primer&SekonderHiperfibrinolizis, Ciprofloxacin

Artmış Shear stress

Konjenital Kardiyak Defektler,

Endokardit,

Damar Bozuklukları,

Şiddetli Atheresklorezis,

Orak Hücre Hastalığı

Azalmış Sentez

Hipotiroidizm

 

 

Veriler Schhneppenheim R, Budde U. Semin Haemost 2005; 42:15-28 alınmıştır(202)

NCCLS H51-A kılavuzunda vWD tanısında; VWFAg ve R:CoF ölçümleri için kantitatif immünoassay yöntemlerini önemektedir(50). vWFAg için ELİSA yöntemini, R:CoF için ise trombosit aglütinasyon hızı ölçüm yöntemini önermektedir.

2.10.2.7. Fibrinolitik metotlar 

2.10.2.7.1. Plazminojen/Plazmin

Plazmin,fibrini parçalayarak pıhtının çözülmesine neden olan enzimdir. Plazmin dolaşımda plazminojen (inaktif) olarak bulunur. Plazminojen primer olarak, endotel hücrelerden salınan t-PA ile aktive edilir. Ancak plazminojenin tek aktive olma yolu bu değildir. Plazminojen aynı zamanda kontak aktivasyon yoluyla da ( FXII, HMWK, PK) aktive olur. Bu ikinci yolun in vivo ortamda pek önemli bir katkısı olmadığı anlaşılmış olmakla beraber, kontak aktivasyon yolunda görev alan faktörlerin eksikliği tromboza meyil yaratabilir. Plazminojen aynı zamanda  ürokinaz-tipi plazminojen aktivatörü  (u-PA), streptokinaz, ve farklı sürüngen (yılan) venomları ile de aktive olabilir. Rekombinan t-PA, u-PA ve streptokinaz pıhtı eritmek amaçlı tedavide (derin ven trombozu, pulmoner emboli, koroner arter trombozu) kullanılan ajanlardur.

Fibrinin plazmin ile yıkımı sonucu fibrin yıkım ürünleri  (fibrin degradation products [FDP]) ortaya çıkar. Fibrin yıkım ürünleri, fibrinojenin yerine fibrin pıhtısına yerleşerek koagülasyonu ve ayrıca trombosit agregasyonunu inhibe eder. FDP düzeyini ölçmek amacıyla kullanılan birçok test vardır. Bunlar genelde spesifik bir fibrin yıkım ürününden ziyade, birçok üründen oluşmuş bir karışımı saptarlar. Fibrin yıkım ürünü ‘assay’leri aslında fibrin yıkımına özgün değildir, plazminojenin fibrinojeni parçalamasıyla oluşan fibrinojen yıkım ürünleri de FDP testinde pozitif sonuçlara yol açabilir. FXIIIa’nın çapraz bağladığı fibrinin parçalanmasıyla oluşan D-dimer ise spesifik bir fibrin yıkım ürünüdür. Dolaşımda D-dimer saptanması bir taraftan trombinin aktive olarak fibrin pıhtısının ve FXIIIa’nın oluşması sonucuna yol açtığını, diğer taraftan da plazminojenin plazmine dönüşüp çapraz bağlanmış fibrin pıhtısını parçaladığını gösterir.

·        Duyarlı D-dimer testleri bazen derin ven trombozu veya pulmoner emboli tanısını dışlamak için kullanılmaktadır. Duyarlı bir test kullanılarak yapılmış ve negatif bulunmuş bir D-dimer ciddi bir trombüs olmadığının kanıtıdır.

Plazmin fibrin pıhtısının yanında fibrinojen ve diğer pıhtılaşma faktörlerini de parçalar bu nedenle fibrinolitik sistemin aşırı çalışması da tehlikelidir ve ciddi kanamalara yol açar; bu nedenle kontrol altında tutulmalıdır. Fibrinolizin sınırlı kalmasını sağlayan önemli kontrol mekanizmalarında biri plazmin aktivitesinin fibrin pıhtısının yüzeyine lokalize olmasıdır. Plazminojen fibrin pıhtısının oluşma aşamasında pıhtının içine bağlanır. Doku plazminojen aktivatörünün bağlı plazminojene serbest plazminojenden daha yüksek bir afinitesi vardır; bu sayede fibrinoliz pıhtı yüzeyinde sınırlı kalır. Bir başka kontrol mekanizması da serbest dolaşan plazmini parçalayan a2-antiplazmindir. Fibrine bağlanan plazmin a2- antiplazmin’in bu etkisinden korunur(55,175,205). 

2.10.2.7.1.1. Plazminojen Aktivasyonunun İnhibe Edilmesi

Nasıl plazmin inhibitörleri varsa, plazmada dolaşan plazmin aktivasyon inhibitörleri de vardır. t-PA’nın primer inhibitörü plazminojen aktivatör inhibitörü-1’dir (PAİ-1). Bir ikinci t-PA inhibitörü de plazminojen aktivatör inhibitörü-2 (PAİ-2) olarak adlandırılmaktadır. PAİ-2’nin konsantrasyonu gebelik döneminde yükselir; bu dönemde plasental dolaşımda da yüksek miktarlarda bulunur. Gebelik dönemi dışında ciddi bir rolü yoktur.

Doku tipi plasminojen aktivatörü(tPA) fibrinolitik sistemin ana bileşenidir. Çünkü tPA plasminojeni plazmine dönüştürerek fibrini paraçalayarak değişik yıkım ürünleri oluşturur( Şekil 37)

 Plazminojen aktivatör inhibitör-1 (PAI-1) tPAnın majör inhibitörüdür. Hem tPA hemde PAI-1 trombotik hastalıklarla ilişkilidir ve  fonksiyonel ve antijenik metotlarla ölçülebilir. Bu metotların analiz öncesi dikkat edilecek önemli noktalar örnek alma tüpüyle başlar.  Çünkü tPA aktivitesinin yarılanma süresi birkaç dakika ile birkaç saat arasında değiştiği için plazmada stabil değildir. tPAnın PAI-1 ile hızlı inhibisyonunun durdurmak mümkün olmayabilir. Bundan dolayı dolaşımdaki tPA aktivitesinin seviyesi beklenenin altında çıkmasıyla sonuçlanabilir. Asidik pH’lı(4.0) sitrik asit içeren sitratlı kan toplama tüpleri kanın pHsını ~ 5.9 a düşürür. Bunun sonucunda tPA/PAI-1 kompleks oluşumunu inhibe eder. Bu pH öglobulin çökeltisinin oluşumundan  sorumludur. Bu metot eskiden plazma fibrinolitik aktivite çalışmalarında kullanılmıştır.

Hasta hazırlanması da aynı derecede çok önemlidir. Hematokrit değerleri duruşa göre değiştiğine göre ya oturarak  yada 20-30 dakika yatırarak stabilizasyon yapılmalıdır. Hastalar minimum stresli olmalıdır çünkü bu fibrinolitik potansiyeli yükseltir. Sabahları PAI-1 değerlerinin yüksek olduğu için  sirkadyen değişiklikler dikkatle alınmalıdır. Ayrıca sigara ve kahve alımı kan almadan bir saat önce durdurulmalıdır. Alkol alımında önerilen süre 18-24 saattir(55,175,205). 

2.10.2.8. Pıhtılaşma Faktörleri (Faktör II-XII; kontak faktörleri)

Pıhtılaşma faktörleri karaciğerde sentezlenir. FII (protrombin), FVII, FIX ve FX sentezi Vitamin K’ya bağlıdır(tablo-32). Vitamin K,  translasyon sonrası aşamada glutamik asitin  gamma (g) pozisyonuna ekstra bir karboksil grup eklenmesi için gereklidir. Bu işlem sonrası glutamik asit g-karboksi glutamata dönüşür. Vitamin K yokluğunda veya ortamda warfarin gibi vitamin K antagonistlerinin varlığında glutamik asit karboksillenemez ve faktörler biyolojik aktivitelerini kazanamadıkları için koagülasyon kaskadı bloke olur(1,49,55).

Tablo 32. Koagülasyon Proteinlerinin Biyokimyasal Özellikleri

 

MV x 1000

Molekül ağırlığı)

Zincir

 

Ug/mL

Yarılanma ömrü(saat)

Half-life(hrs)

fonksiyon

yorum

                                                                                          procoagulan

Fibrinogen

340

6

2000-4000

72-108

Structual

Acute phase reactant

Prothrombin

72

1

100

96

Serine protease

Vitamin K dependent

Factor V

330

1

7

15-36

cofactor

 

Factor VII

50

1

0,5

5

Serine protease

Vitamin K dependent

Tissue factor

45

1

0

 

cofactor

constitutive

Factor VIII

330

1

0,1

15

cofactor

Acute phase reactant

Factor IX

57

1

5

24

Serine protease

Vitamin K dependent

Factor X

56

2

10

30-50

Serine protease

Vitamin K dependent

Factor XI

125

2

4 to 6

52

Serine protease

 

Factor XII

76

1

29-40

48-70

Serine protease

Contact factor

Prekallikren

85-88

1

35-45

35

Serine protease

Contact factor

High molecular weight kininojen

120

1

70-90

156

cofactor

Contact factor

Von Willebrant factor

500-20,000

multiple

10

 

 

 

                                                                                         kontrol proteinleri

Protein C

62

2

4

8 to 10

Serine protease

Vitamin K dependent

Protein S

69

1

20-25

42

cofactor

Vitamin K dependent

Antithrombin

58

1

125

61-72

SERPİN

 

Thrombomodulin

450

1

 

 

cofactor

constitutive

Tissue factor pathway inhibitor

42

1

0.01-0.15

1 to 2 min

SERPİN

 

Heparin cofactor II

65

1

33-90

 

SERPİN

 

Alpha-1-antitrypsin

60

1

25

 

SERPİN

 

Alpha-2-macroglobulin

725

4

2000-3000

60

SERPİN

 

                                                                                               Fibrinolitik proteinler

Plasminogen activator inhibitor-1

50

1

0.02

 

SERPİN

Acute phase reactant

Plasminogen

90

1

15-21

24-26

Serine protease

 

Tissue plasminogen activator

68

1

4 to 7

 

SERPİN

 

 

FVIII dolaşımda vWF’ye bağlı olarak bulunur. vWF’ün bağlanmasıyla dolaşımdaki FVIII’in yarı ömrü uzar. Bu nedenle vWF eksikliğinde veya anormal vWF varlığında plazma FVIII düzeylerinde düşüklükler gözlenir. FVIII-vWF kompleksi için kullanılan eski terminoloji kafa karıştırıcıdır. Bu kompleksin koagülan kısmına eskiden FVIII koagülan (factor VIII:C), vWF kısmına ise FVIII ile ilişkili antijen (factor VIII–related antigen [faktör VIII:Rag]) denirdi. Günümüzde koagülan kısım FVIII, vWF kısmıda vWF olarak adlandırılmaktadır.

Pıhtılaşma faktörleri iki yolla ölçülebilir: pıhtı bazlı yöntemler (aktivite ölçen yöntemler) ve immünolojik yöntemler (enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA] veya benzeri immünotestler). İmmünolojik yöntemler faktör proteininin mutlak konsantrasyonunu (mg/dl) verir; ama proteinin işlevselliği hakkında bilgi vermez. Pıhtı bazlı yöntemler spesifik bir faktörün ne düzeyde işlevsel aktivitesinin bulunduğunu gösterir, ancak aktivite düzeyi her zaman protein konsantrasyonu ile korelasyon göstermez. Bazı hemofili hastalarında mutasyon sonucu işlevselliği olmayan faktörler üretilir. Bu durum ancak aktivite ölçen yöntemlerle gösterilebilir. Pıhtı bazlı yöntemlerin normal değer aralığı oldukça geniştir: sınırlar genellikle %50-%150 veya %75-%150 arasındadır.

 

Plazmadaki pıhtılaşma faktörlerinin aktivitelerine genellikle tek evreli pıhtılaşma testleri kullanılarak bakılmaktadır. İki evreli ve amidolitik (kromojenik) yöntemler mevcutsa da nadiren kullanılmaktadır. İlk yıllarda faktör eksikliği bulunan hastalardan alınan plazma örnekleri yardımı ile faktör eksikliklerine bakılıyordu; ancak bazı nadir faktör eksiklikleri için plazma bulunamaması ve hasta kanında HIV veya hepatit bulunabilme olasılığı nedeniyle bu yöntemden vazgeçilmiştir. Bu nedenle günümüzde çalışılacak faktörden arındırılmış (<%1) liyofilize, immünoadsorbsiyon uygulanmış insan plazması kullanılmaktadır. Faktörden eksik plazma, hastanın plazması ile 1:1 oranında karıştırıldığında ölçülen PT veya aPTT düzeyi, hastanın plazmasındaki faktörün düzeyine bağlı olacaktır. Hasta plazmasındaki faktör aktivite düzeyi, daha sonra faktörden eksik substrat ile bilinen faktör aktivitesine sahip seri şekilde dilüe edilmiş referans plazmanın 1:1 karışımları için hazırlanmış PT/aPTT eğrilerinden okunarak bulunur. Faktör II, V, VII ve X,  PT, Faktör VIII, IX, XI ve XII ile kontak faktörleri (prekallikrein ve yüksek moleküler ağırlıklı kininojen) ise aPTT üzerinden ölçülmektedir. Faktör ölçümünün hassasiyeti, birkaç farklı dilüsyonda ölçüm yapıp ortalama değeri alarak geliştirilebilir. Faktör inhibitörleri, yeterli düzeyde seyreltilmedikleri sürece faktör sonuçlarını etkieleeye devam eder. aPTT veya PT uzamasının nedenini anlayabilmek için faktör ölçümü yapmak vazgeçilmez bir gerekliliktir. Bu aynı zamanda hastaları izlemek ve uygun tedavi önermek açısından da önemlidir. Bazı hastalarda zayıf bir inhibitör olasılığı, sadece dilüsyon eğrilerinin non-lineer olmamasından bile fark edilebilir.

Faktör eksikliklerinde kullanılan testlerin ne derece duyarlı olduklarının önceden bilinmesi yararlı olur. Örneğin, PT veya APTT pıhtılaşma faktörlerinin düzeyi %30’un üzerinde (tek faktör eksikliğinde) olduğu sürece genellikle normaldir. Çoklu faktör eksikliklerinde ise faktörlerin düzeyi %50’nin üzerinde olduğunda pıhtılaşma testleri yine normal çıkacaktır. Bazı cihaz ve yöntemlerle daha düşük faktör seviyelerinde bile PT, APTT normal bulunabilmektedir. Bu nedenle, normal sınırlarda olan bir PT veya PTT sonucu hafif düzeyde faktör eksikliklerini dışlamak için yeterli ve güvenilir bir yöntem değildir(1,49,55).

NCCLS; H48-A dokümanında, fibrinojen dışındaki tüm intrinsik, ekstrinsik ve ortak koagülasyon faktörlerinin tümünün koagülan aktivitesini ölçümü için genel tavsiyeleri önermektedir. Plazmadaki pıhtılaşma faktörlerinin aktivitelerinde genellikle tek evreli pıhtılaşma testlerini önermektedir. Doküman test plazmasının faktör eksik plazmanın APTT veya PT’sini düzeltme yeteğini ölçen tek basamaklı testler ile sınırlıdır. H48-A; klasik APTT ve PT koagülasyon testlerine dayalı tek basamaklı koagülasyon faktör testlerinin rutin olarak gerçekleştirilmesinden sorumlu olan laboratuar ve/veya klinik sağlık-bakım profesyonellerine yönelik bir performans kılavuzudur(49).

2.10.2.9. Reptilaz zamanı 

Reptilaz zamanı, reptilaz (Batroxobin, Atroxin) tarafından fibrinojenin fibrin pıhtısına dönüşme zamanını ölçmektedir. Reptilaz  fer–de-lance’dan  (barba amarilla, Bothrops atrox) elde edilen trombin benzeri bir enzimdir. Fibrinojen molekülünden fibrinopeptid A, AP ve B’yi parçalayan trombinden farklı olarak reptilaz sadece fibrinopeptid A ve AP’yi parçalar. Ortaya çıkan fibrin monomerleri  ucuca gelerek polimerize olur ve bir fibrin pıhtı oluştururlar. Reptilazın fibrinolitik aktivitesi yoktur. Plazminojeni aktive etmez ve antifibrinolitiklerden trombin inhibitörlerinden (heparin, hirudin, antitrombin antikorlar) veya antitrombin III’ten etkilenmez.

Reptilaz zamanı uzamış aPTT’yi değerlendirmek için kullanılır. Özellikle disfibrinojenemi varlığını ekarte  etmek için başvurulan bir yöntemdir. Hipofibrinojenemi ve disfibrinojenemi uzamış reptilaz zamanının beklenen nedenlerindendir. Hem trombin zamanında hem de reptilaz zamanın uzaması hipofibrinojenemi veya disfibrinojenemi düşündürür. aPTT uzamış ancak reptilaz zamanı normalse, ortamda heparin veya başka antitrombinler var demektir. Trombinle reaksiyona giren miyelom proteinleri reptilaz zamanını uzatabilir. Fibrin yıkım ürünlerinin (FDP) de reptilaz zamanında hafif uzamaya neden olabileceği bildirilmiştir(55,206).

2.10.2.10. Trombin Generasyon Testleri

            Genel koagülasyon fonksiyon testleri yakın zamanlarda trombin-generasyon deneyleri      ( TGA) olarak isimlendirilmiştir ve bu hemostatik sistemin global değerlendirilmesine imkan tanımıştır. TGA, Fluorogenik sustrat kullanılarak trombin generasyon eğrisi tam otomatik tarzda yapılır. TGA hiperkoagülabilite durumu ve hemorajik diyatezin taranmasında yararlıdır ve yeteri kadar duyarlıdır(2,207).

            Bu test için güvenilir sonuçlar elde etmek için spesifik özellikler ve kriterler  gereklidir ve doğru bir şekilde standartize edilmesi gereklidir. Temel olarak bu test fibrinsiz PPP plazmada, fibrin olmayan PRP ve tam kanda yapılabilir. Bununla beraber ana parametreler ve PPP, PRP ve tam kan örneklerinden elde edilen trombin generasyon eğrisi diagnostik etkinliğinin şartları global olarak karşılaştırlılabilmelidir, absolut değerler açıkca karşılaştırılamaz ve birbirinin yerine gecemez. Tam kan örneklerinde trombin aktivitesi total miktarı üretilir ve elde edilen trombin maksimal hematokritle orantılıdır ve Hematokrit tamamıyle konu ileilgili hücre konsantrasyonuyla ilgilidir. Kırmızı hücre lizatı da trombin generasyonunu  arttırır, kan toplanması sırasında veya filtrasyonla lizat eliminasyonu başarmak için hasarlı hücrelerden salınan fosfolipitlerden dolayı sürekli kaliteli örnek elde etmek gereklidir.

            Endojen trombin ile hızlı sürede oluşan integral trombin miktarı, dondurulmuş çözülmüş PRP’de yeteri kadar çok  değiştirilmemiş olduğu görülür, lag süresi azalır ve trombin oluşumu artar ve hızlandırılır, soğuğun neden olduğu trombosit aktivasyonundan dolayı membran zarar görür ve prokoagülant fosfolipitleri ortaya çıkar.  Çözülmüş örneklerde rezidu trombositlerin sayısıyla ve trombin generasyon eğrisinin birçok parametreleri arasında lineer bir  ilişki vardır. Dondurulmuş-çözülmüş PRP örneklerinde bazı TGA parametrelerinde önemli sapmaya neden olur. TGA’da, trombositler  eksojen fosfolipitler için ideal değilidir. Çünkü  trombositlerin membranındaki fosfolipitlerin yağ asit kompozisyonu çeşitli hastalar arasında oldukça heterojen olabilir. Bundan dolayı TGA tam kan veya PRP üzerinde değerlendirilmesi ideal olmasına rağmen sadece taze plazma veya  donmuş plazmanın uygun olduğu da önerilmektedir. Rezidü trombositlerin istenmeyen etkilerini elimine etmek için test yapılmadan önce filtre edilmesi sağlanmalıdır. Kan toplam tüpleri de sonuçları etkiler. Vacutainer ve Vacuette plastik tüplerde toplanan kan örneklerinde pıhtılaşma zamanları zamanla azalır, 30 dakikadan sonra maksimum etki görülür. Bunların aksine Monovette plastik tüplerde pıhtılaşma zamanları daha uzun süre kalır ve zamanla azalmaz. Bu etki muhtemelen vacutainer ve vacuette tüplerde kanın yabancı yüzeylerle temasından sonra faktör XII ve Faktör XI’in hızlı aktivazyonundan dolayıdır. Rutin analizlerin pıhtılaşma zamanlarındaki farklılıklar saniyeler aralığı kabul edilebilir (önemsizdir), fakat örneklerde pıhtılaşma zamanları hala uzamış olabilir. Hemoztazda soğuk aktivasyonu rutin hemostaz deneylerinde genellikle tayin edilemez genellikle önemli etkileri trombin generasyon bazlı  kromojenik deneylerde ortaya çıkar(2,207).

 

 

 

 

 

HEMOSTAZ VE TROMBOZ

PDFPrintE-mail

Written by selime Sunday, 29 June 2014 19:40

HEMOSTAZ VE TROMBOZ

1.1. Hemostaz

Kanın pıhtılaşması(hemostaz) ve pıhtının erimesi (fibrinoliz) süreçleri birbiri ile yakından ilişkilidir ve sürekli bir etkileşim halindedir. Hemostatik siteme ait kavram ve kuramlar yeni bilgiler ışığında sürekli bir değişim içindedir. Sistemlerin karmaşıklığı, çok sayıdaki hastalık ve bu hastalıkları saptamada kullanılan testler kafa karıştırıcı olabilir. Tüm bunlara rağmen sınırlı sayıdaki temel testler kullanılarak hemostaz mekanizmasındaki tüm ince detayları akılda tutmaya gerek kalmadan pratik bir yaklaşım yolu bulmak mümkündür. Hemostaz, kan damarları, destek dokular, endotelyal hücreler, trombositler, plazma koagülasyon proteinleri, fizyolojik proteaz inhibitörleri ve fibrinolitik sistem arasındaki etkileşimlerin temelinde idame ettirilen karmaşık bir süreçtir. Hemostatik sistemde meydana gelen değişiklikler, patolojik kanama veya pıhtılaşmalara neden olabilir. Hemostaz sisteminin iki temel özelliği vardır: hassas bir düzenleme ve kontrol ve  yüzey bağımlılığıdır(1).

1.1.1. Düzenleme ve Kontrol Mekanizmaları:

  • Hemostazda görev alan her sistem bir başka karşıt işlev gören veya ‘inhibitör’ sistemle dengelenmiştir.
  • Çok sayıda negatif geribesleme döngüsü vardır.
  • Çoğu kez, her sistem karşıt sistemi ile eş zamanlı faaliyete geçirilir. Çoğu zaman bir sistem uyarıldığında kendi karşıt sistemini işleve sokar.

1.1.1.1. Yüzey Bağımlılığı

  • Hemostaz bir fosfolipid yüzey üzerinde işlev görmek üzere tasarlanmıştır. Bu sayede pıhtılaşma süreci sadece hasarlanmış yüzeyle sınırlı kalır ve tüm dolaşım sistemini etkilemez. Trombosit yüzeyindeki fosfolipidler koagülasyon için primer pıhtılaşma alanını oluşturur.

Kalsiyum bağımlılığı koagülasyon sisteminin bir başka özelliğidir. Kalsiyum trombosit fosfolipidleri ile pıhtılaşma faktörleri arasında bir köprü görevi görür, aynı zamanda trombosit aktivasyonu ve agregasyonunda da rol oynar. Kalsiyumun bu fonksiyonundan yararlanarak test tüpleri içine kalsiyum bağlayıcı maddeler yardımıyla aldığımız kan örneklerinin pıhtılaşması engellenir (koagülasyon çalışmaları için sitrat; tam kan sayımı için etilendiamintetraasetikasid gibi [EDTA]).

1.1.12. Hemostatik Sistemde Yer Alan Unsurlar

Hemostatik sistemin en önemli unsurları aşağıda sıralanmıştır:

·        Trombositler

·        von Willebrand faktörü (vWF)

·        Doku faktörü (doku faktörü [TF] koagülasyon kaskadının başlatılmasında kritik öneme sahiptir)

·        Pıhtılaşma faktörleri (koagülasyon kaskadının proteinleri)

·        Fibrinolitik sistem (plasminojen/plasmin, doku plasminojen aktivatörü)

·        Antikoagülan proteinler (antitrombin, protein C, protein S)

·        Endotel hücreleri (trombozu engelleyici rolleri vardır)

Diğer bariz olmayan faktörler arasında, hasar gören kan damarlarının daralması yani vasokostriksiyon (kan kaybını azaltır ve aktive pıhtılaşma faktörlerinin hasarlı alanda kalmasını sağlar) ve kan akımı değişiklikleri (devamlılığı sağlanan kan akımı ile aktive pıhtılaşma faktörleri seyreltilir ve hasarlı bölgeden uzaklaştırılır, böylece pıhtılaşma süreci sınırlanır) sayılabilir.

1.1.1.2.1. Hemostazda Endotel Hücrelerinin Yeri

Endotelyal hücreler birer pasif damar duvarı elemanı olarak görülmemelidir. Tam tersine bu hücreler hemostaz sürecinin aktif katılımcılarıdır. Özellikle de koagülasyonun önlenmesinde önemli rol oynarlar.

·        Endotelyal hücre (EH) yüzey molekülleri: EH’ler koagülasyonun düzenlenmesinde önemli görevlere sahip birçok molekülü yüzeylerinde eksprese ederler. Bunlara örnek olarak heparan sülfat ve trombomodulin (sırasıyla antitrombin ve   protein C-protein S sistemini aktive ederler) verilebilir.

·        Endotelyal hücre metabolik ürünleri: EH’ler trombozun engellenmesinde kritik öneme sahip bir çok metabolik molekül üretirler. Örneğin:  fibrinolitik sistemi faaliyete geçiren doku plasminojen aktivatörü [t-PA]), TF-VIIa-Xa kompleksi üzerinden koagülasyonu inhibe eden doku faktörü yolu inhibitörü (tissue factor pathway inhibitor [TFPI]), ve potent bir vazodilatör ve trombosit antagonisti olan prostasiklin (PGI2). EH’ler ayrıca önceleri endotelyal hücre kökenli gevşetici faktör (endothelial-derived relaxing factor [EDRF]) olarak bilinen ve potent bir vazodilatör ve trombosit antagonisti olan  nitrik oksit  (NO) ve güçlü bir vazokonstriktör olan endotelin maddesini de üretirler.

1.1.1.2.2. Damar Duvarı Bozuklukları

Damar duvarındaki yapısal bozukluklar ve intravasküler olayların direkt hemostazla ilişkisi olmamasına karşın klinik belirti ve bulguları koagülasyon bozukluklarından pek farklı değildir. Bu tür olguların çoğunda bilinen koagülasyon tarama testleri (trombosit sayısı, protrombin zamanı [PT], parsiyel tromboplastin zamanı [PTT]) normaldir. Örnekler:

·        Herediter hemorajik telanjektazi (HHT; Osler-Weber-Rendu sendromu): Bu otozomal dominant geçişli sendromda damar duvar bozukluğuna bağlı olarak vücutta yaygın telanjektaziler görülür. Telanjektazilere bağlı gastrointestinal sistemden, burundan ve diğer muköz membranlardan kanamalar olabilir. Pulmoner hemoraji sorun yaratabilir. Oral mukozada “dut” lezyonları ve özellikle ellerde görülen telanjektaziler karakteristiktir. Bilinen bir tedavisi yoktur. Kronik kanamaya bağlı oluşan demir eksikliğini gidermek için demir replasmanı gerekebilir.

·        Scurvy: Scurvy (vitamin C eksikliği) kapiler damar duvarlarında zayıflamaya bağlı olarak ciltte purpuralar ve mukozal kanamalarla karakterizedir. “Tirbüşon” saçlar/kıllar ve perifolliküler kanama alanları tipik cilt bulgularıdır. Vitamin C’ye yanıt dramatiktir.

·        Vaskülit: Birçok vaskülitik hastalık ciltte purpura veya peteşiye yol açabilir. Bunlar: lökositoklastik (hipersensitivite) vaskülit, ilaca bağlı alerjik reaksiyonlar (penisilin ve diğerleri), kriyoglobulinemi, Henoch-Schönlein purpurası vb. Vaskülite bağlı purpuralar sıklıkla palpabl olurlar; koagülasyon defektlerine bağlı gelişen purpuralar ise genellikle deriden kabarık değildir.

·        Amiloidoz: Ciltteki damarların duvarlarına çöken amiloid materyal damarların frajilitesini arttırır ve purpuralara neden olur.

·        Kortikosteroid fazlası: Cushing sendromlu hastalarda veya yüksek miktarlarda steroid kullananlarda cilt ve damar duvarlarının frajilitesi artar ve kütanöz purpuralar gözlenir.

·        Senil purpura: İlerleyen yaşla birlikte ciltaltı bağ dokusu azalır ve cilt frajilitesi artar, bu da kütanöz purpuraların oluşumu için uygun zemin oluşturur.

1.1.1.3. Primer ve Sekonder Hemostaz

Pıhtı oluşumu klasik olarak iki bölümde incelenir:  primer hemostaz ve sekonder hemostaz. Bu ayrım sunidir ancak olay akışının kolay anlaşılır olmasını sağlar ve görece ayrı klinik sendromlara işaret eder. Kanama bozukluklarında tanı ve tedavi planlaması yapılırken kanamanın primer veya sekonder hemostazdan hangisine bağlı bir bozukluk olduğunun anlaşılması önem taşır.

1.1.1.3.1. Primer Hemostaz

Primer hemostazda  trombositler vevWF görev alır ve sonucunda trombosit tıkacı oluşur. Endotel hasarının küçük olduğu durumlarda tek başına bu tıkaç kanamayı durdurabilir. Ancak hasar büyükse koagülasyon kaskadının da katılımı ile daha kalıcı bir tıkaç oluşumu gerekecektir. Primer hemostazla ilgili bozukluklar Tablo1’ de sıralanmıştır.

Tablo1.Primer Hemostaz Bozukluğu Nedenleri

 

  • Trombositopeni
  • Kalıtsal trombosit fonksiyon bozuklukları: Bernard-Soulier sendromu, Glanzmann trombastenisi, depolama eksikliği
  • von Willebrand hastalığı
  • İlaçlar: aspirin, tiklopidin, klopidogrel, antibiyotikler (penisillinler, sefalosporinler), antihistaminler, öksürük ilaçları (guaifenesin) ve diğerleri
  • Edinsel trombosit fonksiyon bozuklukları: miyelodisplazi, artmış fibrin yıkım ürünleri

 

Primer Hemostaz Bozukluklarının Özellikleri

• Travma, kesiler ve cerrahi/dental girişimleri takiben kanama hemen başlar.

• Mukokutanöz kanamalar: peteşi, kolayca morarma, burun kanamaları, dişeti kanamaları, dışkı ve idrarda kanama ve menorajidir (ağır menstrual kanama).

1.1.1.3.2. Sekonder Hemostaz

Sekonder hemostaz primer olaral koagülasyon kaskad proteinlerinin görev aldığı bir mekanizmadır; faaliyete geçtiğinde fibrinojen, fibrine dönüşür ve fibrin polimerize olarak sekonder tıkaç oluşumuna yol açar. Fibrin tıkacı faktör XIIIa tarafından stabilize edilir. Sekonder hemostaz defektleri Tablo 2’ de sıralanmıştır.

Tablo 2. Sekonder Hemostaz Bozukluğu Nedenleri

·       Hemofililer: kalıtsal pıhtılaşma faktör eksiklikleri veya anormal pıhtılaşma faktörleri

·       Azalmış fibrinojen

·       Karaciğer hastalıkları

·       Warfarin benzeri ilaçlar: vitamin K’ya bağlı pıhtılaşma faktör sentezi ile etkileşirler

·       Fibrin yıkım ürünleri (trombosit fonksiyonları ile etkileşirler)

Sekonder Hemostaz Bozukluklarının Özellikleri

• Kesi ve yaralardan geç kanamalar

• Hemartroz ve intramüsküler hematomlar

• Derin yumuşak doku kanamaları

• İntrakraniyal kanamalar

• Menorajidir.

1.2. Primer Hemostaz Mekanizması

1.2.1. von Willebrand Faktör (vWF)

vWF, endotelyal hücreler ve megakaryositler tarafından sentezlenir. Plazma içinde pıhtılaştırıcı faktör VIII ile kompleks yapmış olarak mevcuttur. Dolaşımda çeşitli boyutlarda multimerler halinde bulunur. Bazı multimerlerin moleküler ağırlığı 20 milyon daltona ulaşır. Bu büyük multimerler normal vWF fonksiyonu için gereklidir. Yüksek moleküler ağırlıklı multimerlerin azalması ya da yokluğunda toplam vWF düzeylerinin normal olmasına karşın kanama bozuklukları ortaya çıkar (bu durum von Willebrand hastalığının [vWH] bir tipi için karakteristiktir).

1.2.2. Trombositler

Trombositler disk şeklinde çekirdeksiz ~2-3 mm çapında hücrelerdir. Normal trombosit sayısı  150.000 – 350.000/ml civarındadır. Trombositler aktin filamentleri, miyozin ve başka kontraktil proteinler içerirler. Bu proteinler sayesinde şekillerini korurlar ve trombosit tıkaçlarını kontrakte edebilirler.

1.2.2.1. Trombosit Reseptörleri

Trombositlerin yüzeyinde çok sayıda glikoprotein bulunur; bunların bir kısmı vWF, fibrinojen ve diğer adhezyon proteinleri için reseptör görevi görür. Birçok trombosit reseptörü 2 veya daha fazla glikoproteinin bir araya gelmesiyle oluşur. Başlıca trombosit reseptörleri aşağıda sıralanmıştır:

  • GP Ib-IX/V (önceki adıyla GP Ib-IX): vWF reseptörüdür. CD sisteminde CD42 olarak adlandırılır.
  • GP IIb-IIIa: Fibrinojen reseptörüdür; aynı zamanda vWF, fibronektin ve diğer adhezyon proteinlerine de bağlanır. CD sisteminde adı CD41/CD61 olarak belirlenmiştir. GP IIb-IIIa aktive olmamış trombosit üzerinde düşük afiniteli ya da inaktif şekliyle bulunur. Trombositlerin ilk adhezyon sonrası aktive olmasıyla GP IIb-IIIa’da konformasyonel bir değişim gerçekleşir ve yüksek afiniteli reseptör haline dönüşür. Ayrıca trombosit aktivasyonu sonrasında ek GP IIb-IIIa molekülleri hücre içinde hücre yüzeyine transfer edilir.

1.2.2.2. Trombosit Granülleri

Trombositler alfa granülleri ve dense (yoğun) cisimcikler adı verilen iki tip spesifik granül içerirler. Alfa granülleri, pıhtılaşma faktörleri (fibrinojen, vWF ve faktör V), trombosite özgü proteinler (b-tromboglobulin, trombosit faktör 4 [platelet factor 4-PF4], trombosit kaynaklı büyüme faktörü [platelet-derived growth factor-PDGF]) ve benzeri moleküller içerir. Dense cisimcikler ise adenozin difosfat, adenozin trifosfat, kalsiyum ve serotonin gibi küçük moleküller ve iyonlar içerir. Trombositler aktive olduğunda trombosit granülleri içindeki bu maddeler ortama salınır. Böylece primer tıkacın oluşmasında gerekecek ilk adım atılır salınan pıhtılaşma faktörleri ve trombosit agonistleri diğer trombositlerin de hasarlı alana toplanmasını sağlar.

1.2.2.3. Trombosit Adhezyon ve Aktivasyonu

Endotel hasarı oluştuğunda, subendotelyal dokuda bulunan kolajen açığa çıkar. Dolaşımdaki yüksek molekül ağırlıklı vWF multimerleri hasarlı alandaki bu kolajene ve trombositler üzerindeki GP Ib-IX/V (vWF reseptörü) proteinine bağlanır. Bu bağlanma trombositlerin adhezyonuna ve aktivasyonuna yol açar. Trombositler üzerinde bulunan bir diğer reseptör GP IIb/IIIa (fibrinojen reseptörü) düşük afiniteli şeklinden yüksek afiniteli haline dönüşür ve yeni GP IIb/IIIa moleküllerinin trombosit yüzeyine çıkmasına neden olur. Trombosit granülleri ortama boşalır; böylece yeni trombositler hasarlı dokuya çekilerek onların da aktive olması sağlanır.

Fosfolipaz A2  enzimi aktive olur, trombosit membranında bulunan fosfolipidlerden araşidonik asit oluşmasını hızlandırır. Araşidonik asit siklooksijenaz ve tromboksan sentetaz enzimleri yardımıyla tromboksan A2 (TxA2)’ye dönüşür. Tromboksan A2 potent bir vazokonstriktördür, aynı zamanda trombosit agregasyonunu ve trombositlerden granül deşarjını uyarır. Siklooksijenaz enziminin inhibisyonu (aspirin ve diğer nonsteroidal anti-enflamatuar ilaçlarla) tromboksan A2 yapımını bloke ettiğinden trombosit agregasyonunu önler.

·        Aspirinin trombosit üzerindeki etkisi, siklooksijenaz enziminin inhibe edilmesi ve takiben tromboksan A2  üretiminin bloke olmasıyla gerçekleşir.

·        Hem prostasiklin (güçlü bir vazokonstriktör ve trombosit antagonisti) hem de TxA2 (potent bir vazokonstriktör ve trombosit agonisti) araşidonik asitten siklooksijenaz yolu ile üretilmektedir. EH’ler daha çok prostasiklin üretirken, trombositler aslen TxA2 üretir.

1.3. Sekonder Hemostaz: Koagülasyon Kaskadı

Koagülasyon faktörlerinin sırayla aktivasyonu sonucu fibrinojenin fibrine dönüşmesi ve takiben fibrinin polimerizasyonu ile bir fibrin tıkacının oluşması sürecine koagülasyon kaskadı denmektedir. Koagülasyon faktörlerinin büyük çoğunluğu serin proteaz yapısındadır. Bu proteinler dolaşımda inaktif öncüller (zimojenler) olarak dolaşır, gereğinde proteazlar tarafından parçalanarak aktif hale getirirler. Bir koagülasyon faktörü bir sonraki faktörü bölerek aktive eder ve fibrinojen fibrine yıkılana dek bu reaksiyon tekrarlanır. Her aktif enzim bir sonraki faktörün birden çok molekülünü aktifleştirdiğinden aktive olmuş faktör moleküllerinin sayısı bir anda geometrik olarak artar. Küçük bir kartopunun dağdan aşağı yuvarlanırken koca bir çığ kütlesine dönüşmesi gibi, aktive koagülasyon faktörleri de koagülasyon kaskadının sonunda bir çığ etkisi yaratacak kadar çoğalmış olurlar.

Pıhtılaşma faktörleri Romen rakamları ile adlandırılmışlardır. Aktif olmayan formlar sadece rakamla gösterilirken aktif koagülasyon faktörlerinde Romen rakamının yanına bir “a” takısı eklenir (örneğin: faktör X [aktif olmayan protein], faktör Xa [aktif protein]). Pıhtılaşma faktörlerinin bazılarına başka adlar da verilmiştir. Ancak bunların çoğu günümüzde kullanılmamaktadır. Örneğin, Faktör VIII’e  antihemofilik faktör; faktör IX’a bazen Christmas faktörü denmektedir. Faktör II yerine  protrombin, faktör IIa yerine  trombin ve faktör I yerine de fibrinojen terimleri tercih edilmektedir (Tablo 3). Romen rakamları ile numaralandırılmamış başka koagülasyon proteinleri de vardır:  yüksek molekül ağırlıklı kininojen (high-molecular-weight kininogen [HMWK]) ve prekallikrein (PK).

Tablo 3.Koagülasyon Faktörleri

Faktör I (fibrinojen)

Faktör II (protrombin)

Faktör III (yaygın adı tromboplastin; doku faktörü)

Faktör IV (yaygın adı kalsiyum)

Faktör V (labil faktör)

Faktör VII (stabil faktör)

Faktör VIII (antihemofilik faktör [AHF], antihemofilik globulin [AHG], antihemofilik faktör A, Faktör VIII:C)

Faktör IX (plazma tromboplastin bileşeni [PTC], Christmas faktörü, antihemofilik faktör B)

Faktör X (Stuart faktörü, Prower faktörü, Stuart-Prower faktörü)

Faktör XI (plazma tromboplastin öncülü [PTA], antihemofilik faktör C)

Faktör XII (Hageman faktörü, yüzey faktörü, kontakt faktörü)

Faktör XIII (fibrin stabilizan faktör [FSF], fibrin stabilizan enzim, fibrinaz)

Diğer faktörler (prekallikrein [Fletcher faktörü], yüksek molekül ağırlıklı kininojen [Fitzgerald faktörü]).

Faktör V ve VIII enzim değil kofaktördür. FVIIIa, FIXa’nın FX’u aktive edebilmesi için gerekli kofaktördür; FVa ise FXa’nın protrombini trombine çevirmesi için gerekli bir kofaktördür. Trombin; Faktör V ve Faktör VIII’i, FVa ve FVIIIa şekline çevirir.

1.4. Koagülasyon Kaskadı (Klasik Anlayış)

Klasik anlayış, koagülasyon kaskadını birbirinden bağımsız iki farklı yol olarak tanımlar: intrinsik yol  (parsiyel tromboplastin zamanı [PTT] ile ölçülür) ve ekstrinsik yol (protrombin zamanı [PT] ile ölçülür). Bu iki yol Faktör X’un aktiflenmesi aşamasında birleşmiş; böylece Faktör X’dan fibrin oluşumuna dek devam eden olaylar bütününe de ortak yol adı verilmiştir ( Şekil 1). Günümüzde artık tek bir koagülasyon yolu olduğu ve eskiden intrinsik yol diye tanımlanan sürecin basitçe bir laboratuar ürünü olduğu bilinmektedir. Ancak koagülasyon kaskadı incelenirken kullanılan iki temel testi (PT, PTT) daha iyi anlayabilmek ve yorumlayabilmek için bu iki yolu bilmek gereklidir.     

  Koagülasyon Kaskadı: Klasik Anlayış

Ekstrinsik Yol

Doku Faktörü

VII      VIIa

İntrinsik Yol

Negatif Yüklü Yüzey

XII     XIIa

XI      XIa

IX      XIa

IX      IXa

VIIIa, Fosfolipid, Kalsiyum

Ortak Yol    X             Xa

                                     Va, Fosfolipid, Kalsiyum

Protrombin (II)            Trombin (IIa)

                                     XIII     XIIIa

Fibrinojen                    Fibrin (Çözünür)    Çözünmez Fibrin

Şekil 1. Klasik anlayışa göre koagülasyon kaskadı.

1.4.1. İntrinsik Yol

İntrinsik yol (diğer adıyla kontakt aktivasyon yolu) negatif yüklü bir yüzeyle temas eden FXII’nin FXIIa’ya dönüşmesiyle başlar. Bu aktivasyon için HMWK ve PK gereklidir. FXIIa daha sonra FXI’i FXIa’ya; FXIa, FIX’u FIXa’ya; FIXa da son olarak FX’u FXa’ya (FVIIIa, kalsiyum, fosfolipid varlığında) aktifler(şekil 1). Bu basamaktan sonra ortak yol içinde kaskad fibrin oluşumuna dek sürer. İntrinsik yolda görev alan faktörlerin herhangi birinde (FXII, FXI, FIX, FVIII, HMWK ve PK) PTT’nin uzamasına neden olacaktır.  Ortak yoldaki faktörlerdeki eksikliklerde hem PTT’nin hem de PT’nin uzaması beklenir.

1.4.2. Ekstrinsik Yol

Ekstrinsik yol (diğer adıyla doku faktörü yolu) doku faktörünün (TF) kan ile teması sonrasında başlar. Doku faktörü kan damarlarının adventisya tabakasında, beyinde, gromerüllerde ve diğer dokularda yüksek miktarda eksprese olan bir transmembran proteindir; normalde endotel yüzeyde veya kan hücrelerinin üzerinde bulunmaz. Açığa çıkan doku faktörü önce dolaşımda bulunan az miktardaki FVIIa ile reaksiyona girerek TF-FVIIa kompleksi oluşturur. Bu kompleks FX’u FXa’ya çevirerek ortak yolu başlatır. Faktör VII eksikliğinde PT uzun bulunur. Ortak yoldaki faktörlerden eksiklik olduğunda da PT uzar ancak  beraberinde PTT’de uzar.

1.5. Koagülasyon Kaskadı (Yeni Anlayış)

Yeni anlayışta, koagülasyon kaskadını başlatan ilk adım TF’nin dolaşıma geçerek  FVIIa ile kompleks oluşturmasıdır. TF-FVIIa kompleksi daha sonra enzimatik olarak FX’yı FXa’ya, FIX’u FIXa’ya ve FXI’i FXIa’ya çevirir. FX’nun FXa’ya dönüşmesi koagülasyon kaskadının başlamasında önemli bir adımdır, ancak endotelden salınan spesifik bir inhibitör olan doku faktörü yolu inhibitörü  (TFPI) hızla TF-VIIa-Xa kompleksini inaktive eder. TF-VIIa kompleksinin in vivo olarak başlıca görevi FIX’un FIXa’a aktive edilmesidir; FIXa daha sonra FX’u FXa’ya çevirir. TF-VIIa kompleksinin FXI’i FXIa’ya çevirmesi koagülasyon kaskadında önemli bir rol oynamadığı düşünülmektedir (Şekil 2).

Koagülasyon kaskadında FX’un FXa’ya ve protrombin (II)’nin protrombin (IIa)’ya çevrilerek aktivasyonu anahtar role sahiptir çünkü hem FXa’nın hem de trombinin daha önceki basamaklar üzerine olumlu geribesleme etkisi vardır. FXa FVII’yi aktive eder  ve dolaşıma doku faktörü ile birlikte kompleks oluşturmak üzere daha fazla FVIIa verilmesini sağlar. Trombin FV’i FVa’ya ve FVIII’i FVIIIa’ya çevirir. Aynı zamanda  FXI’in FXIa’ya ve FXIII’ün FXIIIa’ya dönüşümünü de aktive eder. Trombin ayrıca güçlü bir trombosit agonisti olarak kabul edilmektedir. FX,  FIXa-FVIIIa-fosfolipid ve kalsiyumdan oluşan bir kompleks tarafından aktive edilir. Protrombin ise  FXa, FVa, fosfolipid ve kalsiyumdan oluşturduğu  bir kompleks tarafından aktive olur.

Trombin fibrinojenden iki küçük peptid ayırarak (fibrinopeptid A ve B) fibrinojeni  fibrin monomerlerine çevirir. Fibrin monomerleri kendiliğinden polimerize olarak çözünür fibrin polimerlerine dönüşür. FXIIIa fibrin polimerlerini çapraz bağlarla stabilize eder ve sıkı fibrin tıkacının oluşumunu tamamlar.

1.6. Koagülasyon Faktörlerinin Özellikleri

Pıhtılaşma faktörleri karaciğerde sentezlenir. FII (protrombin), FVII, FIX ve FX sentezi Vitamin K’ya bağlıdır. Vitamin K,  translasyon sonrası aşamada glutamik asitin  gamma (g) pozisyonuna ekstra bir karboksil grup eklenmesi için gereklidir. Bu işlem sonrası glutamik asit g-karboksi glutamata dönüşür. Vitamin K yokluğunda veya ortamda warfarin gibi vitamin K antagonistlerinin varlığında glutamik asit karboksillenemez ve faktörler biyolojik aktivitelerini kazanamadıkları için koagülasyon kaskadı bloke olur.

FVIII dolaşımda vWF’ye bağlı olarak bulunur. vWF’ün bağlanmasıyla dolaşımdaki FVIII’in yarı ömrü uzar. Bu nedenle vWF eksikliğinde veya anormal vWF varlığında plazma FVIII düzeylerinde düşüklükler gözlenir. FVIII-vWF kompleksi için kullanılan eski terminoloji kafa karıştırıcıdır. Bu kompleksin koagülan kısmına eskiden FVIII koagülan (factor VIII:C), vWF kısmına ise FVIII ile ilişkili antijen (factor VIII–related antigen [faktör VIII:Rag]) denirdi. Günümüzde koagülan kısım FVIII, vWF kısmıda vWF olarak adlandırılmaktadır.

1.7. Koagülasyon Kaskadının Doğal İnhibitörleri

Son derece hızlı amplifiye olabilen koagülasyon kaskadının sadece gereken yere sınırlı kalması için kontrol altında tutulması ve sıkı denetlenmesi gerekir. Koagülasyonu inhibe eden faktörler aşağıda sıralanmıştır:

·        Kan akımı ve pıhtılaşma faktörlerinin karaciğer tarafından yıkımı: Normal kan akımı aktive olmuş pıhtılaşma faktörlerini koagülasyon kaskadını tetiklemek için gereken düzeyin altında olacak şekilde seyreltir. Pıhtılaşma bölgesinden kan akımı ile uzaklaştırılan aktive faktörler karaciğerde hepatositler tarafından parçalanarak yok edilir.

·        Antitrombin: Antitrombin (AT; eski adıyla antitrombin III [AT III])  aktive olmuş pıhtılaşma faktörlerinin bilinen en önemli fizyolojik inhibitörüdür. Antitrombin karaciğer ve endotel hücrelerinde sentezlenir. Geri dönüşümsüz olarak trombin, FXa ve diğer aktive pıhtılaşma faktörlerine bağlanan AT bu faktörleri inhibe eder. Heparin (veya endotel hücreleri üzerindeki heparan sulfat) AT’ye bağlanır ve  onu aktive eder. AT’nin kendi başına trombine olan afinitesi düşüktür; ama  heparinle bağlandıktan sonra aktivitesi yaklaşık 1.000 kat artar.

·        Protein C ve  protein S: Protein C ve S  koagülasyon kaskadının vitamin K’ya bağlı doğal inhibitörleridir. Koagülasyonu FVa ve FVIIIa’yı inaktive ederek kontrol altında tutarlar. Protein C trombinin endotel yüzeyinde trombomodulin ile bağlanması sonucu aktive olur. Trombin, bu anlamda, hem pıhtı oluşumunda hem de antikoagülan sistemin faaliyete geçmesinde kilit role sahiptir. Trombomoduline bağlanan trombin daha fazla fibrinojeni fibrine dönüştüremez, bunun yerine enzimatik olarak protein C’yi aktive eder. Aktive protein C protein S ile birlikte FVa ve FVIIIa’yı etkisizleştirir. Protein S dolaşımda iki şekilde bulunur: (1) serbest protein S ve (2) kompleman sistemde yer alan bir protein olan C4b ile kompleks yapmış protein S. Serbest protein S aktiftir, bağlı olan ise aktif değildir. Akut inflamasyonda görüldüğü gibi C4b düzeyindeki artışlar serbest protein S düzeylerinde düşüşe neden olarak  tromboza yatkınlık yaratabilir.

1.8. Fibrinolitik Sistem

Hemostaz sürecinde fibrinoliz (pıhtının erimesi) en az koagülasyon kaskadı kadar önemlidir(Şekil 3). Fibrinolizin başlıca elemanları plazminojen/plazmin ve t-PA’dır. Bunun dışında plazmin inhibitörleri (en bilineni is a2-antiplasmin’dir) ve plazminojen aktivasyon inhibitörleri de vardır.

1.8.1.Plazminojen/Plazmin

Plazmin,fibrini parçalayarak pıhtının çözülmesine neden olan enzimdir. Plazmin dolaşımda plazminojen (inaktif) olarak bulunur. Plazminojen primer olarak, endotel hücrelerden salınan t-PA ile aktive edilir. Ancak plazminojenin tek aktive olma yolu bu değildir. Plazminojen aynı zamanda kontak aktivasyon yoluyla da ( FXII, HMWK, PK) aktive olur. Bu ikinci yolun in vivo ortamda pek önemli bir katkısı olmadığı anlaşılmış olmakla beraber, kontak aktivasyon yolunda görev alan faktörlerin eksikliği tromboza meyil yaratabilir. Plazminojen aynı zamanda  ürokinaz-tipi plazminojen aktivatörü  (u-PA), streptokinaz, ve farklı sürüngen (yılan) venomları ile de aktive olabilir. Rekombinan t-PA, u-PA ve streptokinaz pıhtı eritmek amaçlı tedavide (derin ven trombozu, pulmoner emboli, koroner arter trombozu) kullanılan ajanlardur. 

Fibrinin plazmin ile yıkımı sonucu fibrin yıkım ürünleri  (fibrin degradation products [FDP]) ortaya çıkar. Fibrin yıkım ürünleri, fibrinojenin yerine fibrin pıhtısına yerleşerek koagülasyonu ve ayrıca trombosit agregasyonunu inhibe eder. FDP düzeyini ölçmek amacıyla kullanılan birçok test vardır. Bunlar genelde spesifik bir fibrin yıkım ürününden ziyade, birçok üründen oluşmuş bir karışımı saptarlar. Fibrin yıkım ürünü ‘assay’leri aslında fibrin yıkımına özgün değildir, plazminojenin fibrinojeni parçalamasıyla oluşan fibrinojen yıkım ürünleri de FDP testinde pozitif sonuçlara yol açabilir. FXIIIa’nın çapraz bağladığı fibrinin parçalanmasıyla oluşan D-dimer ise spesifik bir fibrin yıkım ürünüdür. Dolaşımda D-dimer saptanması bir taraftan trombinin aktive olarak fibrin pıhtısının ve FXIIIa’nın oluşması sonucuna yol açtığını, diğer taraftan da plazminojenin plazmine dönüşüp çapraz bağlanmış fibrin pıhtısını parçaladığını gösterir.

  • Duyarlı D-dimer testleri bazen derin ven trombozu veya pulmoner emboli tanısını dışlamak için kullanılmaktadır. Duyarlı bir test kullanılarak yapılmış ve negatif bulunmuş bir D-dimer ciddi bir trombüs olmadığının kanıtıdır.
  • Plazmin fibrin pıhtısının yanında fibrinojen ve diğer pıhtılaşma faktörlerini de parçalar bu nedenle fibrinolitik sistemin aşırı çalışması da tehlikelidir ve ciddi kanamalara yol açar; bu nedenle kontrol altında tutulmalıdır. Fibrinolizin sınırlı kalmasını sağlayan önemli kontrol mekanizmalarında biri plazmin aktivitesinin fibrin pıhtısının yüzeyine lokalize olmasıdır. Plazminojen fibrin pıhtısının oluşma aşamasında pıhtının içine bağlanır. Doku plazminojen aktivatörünün bağlı plazminojene serbest plazminojenden daha yüksek bir afinitesi vardır; bu sayede fibrinoliz pıhtı yüzeyinde sınırlı kalır. Bir başka kontrol mekanizması da serbest dolaşan plazmini parçalayan a2-antiplazmindir. Fibrine bağlanan plazmin a2- antiplazmin’in bu etkisinden korunur.

1.8.2. Plazminojen Aktivasyonunun İnhibe Edilmesi

Nasıl plazmin inhibitörleri varsa, plazmada dolaşan plazmin aktivasyon inhibitörleri de vardır. t-PA’nın primer inhibitörü plazminojen aktivatör inhibitörü-1’dir (PAİ-1). Bir ikinci t-PA inhibitörü de plazminojen aktivatör inhibitörü-2 (PAİ-2) olarak adlandırılmaktadır. PAİ-2’nin konsantrasyonu gebelik döneminde yükselir; bu dönemde plasental dolaşımda da yüksek miktarlarda bulunur. Gebelik dönemi dışında ciddi bir rolü yoktur.

   

PERİFERİK YAYMA İLE İLGİLİ BİLMENİZ GEREKENLER

PDFPrintE-mail

Written by selime Saturday, 28 June 2014 20:16

3.5.3. Periferik Yayma İnceleme Protokolü(NCCLS)

3.5.3.1. Periferik Yayma Hazırlama

3.5.3.1.1. Referans Metot (213)

  1. Temiz, kuru ve toz içermeyen 25 x 75 mm (1 x 3 inç), 0.8 x 1.2 mm kalınlığında, kaliteli, cam mikroskop lamı üzerinde her bir örnekten üç yayma  hazırlanır. Lamlar A, B ve “yedek” olarak etiketlenir. İki yayma prosedür için kullanılacak ve üçüncüsü yedek olarak saklanacaktır. Kan lökopenik ise, daha fazla sayıda kan yayma örneği hazırlanmalıdır.
  2. EDTA içerisine alınan venöz kan örneği veya deriye giriş yoluyla alınan kan ile yaymalar hazırlanabilir(Şekil 44/A). Yaymalar alındıktan sonra 4 saat içinde yayılmalıdır. Kan buzdolabında saklanmamalıdır. Periferik yayma hazırlamadan önce kanı elle 20 kez alt-üst etmek gereklidir.
  3. Periferik yaymalar  lam (kama) metodu ile hazırlanır. İyi karışmış kanın bir  damlasını (yaklaşık 0.05 mL) cam mikroskop lamının bir ucuna yakın yere koyulur. İkinci, kenarları cilalanmış daha dar yayma lamını yaklaşık 45 derece açıyla tutulur ve hemen kan damlasının üzerine doğru çekilir. (Şekil 44/B) Kanın lam boyunca yayılması sağlanır. Daha sonra yayıcı lamı lamın diğer ucuna doğru hızla ve düz olarak, kanı arkasına doğru çekecek şekilde itilerek hazırlanır(Şekil 44/C-D)

 

A. Parmak Ucundan Kan Örneğinin Alınışı

 

 

 

 

 

 

B. Kan Örneğinin Lam Üzerine Konulması

 

 

 

 

 

C. Yaymanın Lam Yöntemi İle Yapılması

 

 

 

 

 

 

 

 

      D.İyi Hazırlanmış Yayma Örnekleri

       Şekil 44. Periferik Yaymanın Lam Metodu İle Hazırlanması

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. Yaymayı hazırladıktan sonra bir saat içerisinde fiksatif içeren Romanowsky boyası ile boyanır veya daha sonra boyama için “su içermeyen” (< %3 su) metanol ile bir saat içerisinde fikse edilir. Yaymanın arkasının mavi boyanmasını önlemek için,  yaymalar hazırlandıktan sonraki birkaç saat içinde boyanmalı veya boyanmadan saklanmaları gerekiyorsa fikse edilmelidir. Fiksasyon ve boyama lamların reaktif ile doldurulmuş kavanozlara daldırılmasıyla veya yatay olarak desteklenmiş lamların veya lamellerin reaktifle kapatılmasıyla yapılabilir. Ançak bu yöntemde çok fazla boyanan yaymanın kapatılması buharlaşmayı önleyeceği için çökelmelere neden olabilir.
  2. Boya yatay lamdan su ile yıkanarak uzaklaştırılır. 30 saniyeden daha uzun süreyle yıkama mavi boyanmayı azaltır. Lamın arkası gazlı bezle silinir.
  3. Lam eğik pozisyonda ortam havasında kurumaya bırakılır.

 

3.5.3.1.2. Yaymalarda  Aranan Özellikler

 

1. Yeterli çalışma alanı olmalıdır.

2. En az 2.5 cm uzunluk; lamın ucuna göre en az 1 cm geride sonlanmalıdır.

3. Kalınlıkta dereceli azalma (kalından inceye); kare veya düz kenarda sonlanmalıdır.

4. Çalışma alanı içerisinde kabul edilir morfoloji olmalıdır.

5. Yaymanın  yayıldığı lamdan daha dar olan lam düz ve süreklilik sağlayacak şekilde yayılmalı ve alanlar imersiyon incelenmesinde kolay bulunmalıdır.

6. Teknik artefakt oluşturmamalıdır

7. Minimum dağılım hatası olmalıdır.

8. Giderek incelen en uç kısım; tümsek, çukur veya pürüz olmamalıdır; bunların tümü bu bölgeye giden lökosit sayısındaki artışı gösterir.

Anemi veya polisitemi olgularında ya da anormal plazma proteinlerin (örn, miyelomda, soğuk aglütinin hastalığında) bulunduğu olgularda periferik yaymaların çok uygun olarak hazırlanmadığı görülmüştür.

 

3.5.4. Periferik  Yayma Sayım Prosedürü

3.5.4.1.Referans İşlem

 

1. Bu inceleme için “mazgal” sistemi kullanılır(Şekil 45). Tanımlanan her hücre aşağıdaki kategorilere yerleştirilmelidir: nötrofil, segmentli; nötrofil, bant; lenfosit, normal; lenfosit, varyant; monosit, eozinofil; bazofil; diğer çekirdekli hücreler (çekirdekli kırmızı hücreler dışında). Belirgin biçimde tanımlanabilen şekli bozulmuş hücreleri uygun sınıfa yerleştirilir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

   Şekil 45. Periferik Lamlarda Sayım Tekniği Gösterilmektedir.Lam Metodu İle Hazırlanan Periferik

 

 

 

 

 

 

“Yaymaların İnceleme Alanları . Oklar İnceleme Alanını(İnce Uç) Göstermektedir.

 

2. Her lamda 200 lökosit sayılmalıdır. Kan lökopenik ise, paralel olarak ek lamlar incelenmelidir.

3. Alt tip sayısı sonuçlarını fraksiyon cinsinden olarak ifade edin (sayılan tüm lökositlerin yüzdesi).

4. Mevcut çekirdekli eritroid hücreleri sayılır ve sonuc sayılan 100 lökosit başına düşen sayı olarak belirtilir.

 

3.5.5. Periferik Yaymanın Mikroskopik İncelenmesi

3.5.5.1.Referans Metot

 

Lökositleri Romanowsky tipi boyalar ile boyanmış  yaymalarda incelemeden önce kişi yaymanın iyi hazırlanıp hazırlanmadığını, hücre dağılımının homojen olup olmadığını ve hücrelerin tatmin edici şekilde boyanıp boyanmadığını belirlemelidir.

1. Kan yayması ilk önce küçük büyütme ile (10x- 40x objektif) incelenmeli ve hücre dağılımı, sıradışı veya anormal hücreler ve boyamanın yeterliliğine bakılmalıdır. 100 x yağ imersiyon objektiflerinin çoğu sitoplazmik granülleri ve nötrofilik filamentleri  göstermek için kullanılır Bu objektifde lökosit sayımı da yapılabilir ve blastlar veya çekirdekli kırmızı kan hücreleri gibi anormal hücre unsurları taranabilir. Yaymanın kenarlarında yoğunlaşabilecek anormal popülasyonların atlanmaması için tüm kan yaymasının taranması önemlidir. Yağ imersiyon merceğinin (50 veya 63 x) kullanımı lökosit alt tip sayımları için genellikle yeterlidir ancak 100x yağ merceği hücre inklüzyonları veya sitoplazmik granüllerin incelenmesi için gerekebilir. Tüm hücre tiplerinin incelenip tanımlanabilmesi için kan yaymasının sistematik değerlendirmesi şarttır. Her hücre tipi hem kantitatif hem de kalitatif anormallikler açısından değerlendirilmelidir. İlk önce lamın sayım bölgesi, monositlerin, nötrofillerin ve büyük anormal hücrelerin   eğilim gösterdiği lateral ve ince sivri kenarlar gözden geçirilir(Şekil 34). Kuşkulu hücreler 100x büyütmede saptanır ve yüksek büyütmede doğrulanır. Çekirdekli kırmızı hücreler, makrofajlar, olgunlaşmamış granülositler, olgunlaşmamış lenfoid hücreler, megakaryositler ve anormal hücreler kanda normalde bulunmadığından, bunlar varsa kaydedilir(Şekil 46).

2. İnceleme eritrositlerin yaklaşık %50’sinin düzgün dağıldığı  bölgeye doğru genişletilir ve eritrositler periferik yaymanın ince uç adı verilen  kısmında incelenir(şekil 47). Normal bir hasta örneğinin inceleme alanında, eritrositlerin ortalama büyüklüğü (oküler mikrometre kullanılarak en uzun ve en kısa çapların ortalamasıyla ölçülür) 0.3 mikrometre ve standart sapma 200 civarında sabit olmalıdır ve komşuluklarıyla birlikte tekli eritrositler 0.6 mikrometreyi aşmamalıdır.

3. Total lökosit sayısı litrede 4 x 109  olduğunda, kabul edilebilir çalışma alanında ve en az 300 lökosit olmalıdır.

4. Nötrofiller, monositler ve lenfositler yaymanın “kullanılabilir” alanlarında eşit dağılmış olmalıdır.Toplam lökosit sayısı normal sınırlarda olduğunda, uç taraftaki 100x alanda bulunan lökosit  sayısı yaymanın tamamında alan başına düşen sayının 2-3 katından fazla olmamalıdır. Yan kenarlar yaymanın tamamına göre 100x alan başına düşen hücre sayısından 2-3 kat daha az hücre içermelidir.

 5. Patolojik durumlar (örn., kronik lenfositik lösemi) ile ilişkili belirli formlar dışında, lökositlerin %2’den azı parçalanmış veya tanımlanmamış formlar olmalıdır. Sadece parçalanmış hücre hala belirgin biçimde saptanabiliyorsa (örn, eozinofil) alt tip sayımına dahil edilmelidir. Tanımlanamayan parçalanmış hücreleri (sepet hücreleri vs.) “diğer” kategorisinde sınıflanmalı ve laboratuar raporuna açıklama yapılmalıdır.

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 46. Lamın uç kısımlarında(mor renkli)

büyük hücreler, trombosit kümeleri, mikrofilamentlere bakılır

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 47.Lamın gövde kısmında(mor renkli kısım) rulo

formasyonu ve eritrosit aglütinasyonuna bakılır

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 48. Orta kısımda (mor renkli kısım) hücre morfolojisi incelenir ve tahmini lökosit ve trombosit sayısı

 hesaplanır.

 

 

Sayım kaydı mekanik veya elektronik çizelge kullanılarak yapılabilir. Sınıflanamayan lökositler “tanımlanamamış” grubuna yerleştirilmelidir. Bazı durumlarda (özellikle lösemi) tanımlanmamış pek çok lökosit olabilir. Lökosit alt tip sayım prosedüründe eritrositlerin ve trombositlerin morfolojisi incelenir ve trombositlerin sayısı hesaplanır(Şekil 48 ).

Her bir lökosit tipinin mutlak konsantrasyonu, onun yüzdesi ile total lökosit sayısının çarpımıdır. Mutlak konsantrasyonda artış mutlak artıştır; yüzdede artış relatif artıştır. Örneğin, düşük total lökosit sayısında nötrofil sayısı normal (yüzdesi normal) olabilir  ancak mutlak sayısı azalmış olabilir. Referans aralıkları yüzdeler yerine mutlak konsantrasyonlar şeklinde verilmelidir.

 

3.5.6.Periferik Yaymayı İnceleyen Kişinin Özellikleri

3.5.6.1. İnceleyen Kişinin Deneyimi

 

Olgunlaşmamış ve anormal hücre morfolojisini inceleme deneyimi ve eğitimi şarttır. İnceleyen kişi tüm yaygın lökositleri sınıflayabilmeli ve hem konjenital hem de edinsel lökosit varyasyonlarının çoğunu bilmelidir(213). Periferik yayma inceleyen kişi eğer bir  yayma için 200 hücre sayıyorsa bu kişinin bir günde bakabileceği periferik yayma sayısı 15-25 arasında olmalıdır.

 

3.5.6.2.Yasal Konular

 

Lökosit alt tipleri Klinik Laboratuar İyileştirme Düzeltmeleri 1988 (CLIA-88)’i uygulamaya koyan yönetmeliklerde “orta derecede karmaşık” şeklinde sınıflanır.  Ancak atipik ve anormal hücrelerin tanımlanması orta karmaşıklıktan yüksek derecede karmaşık teste kadar değişir. Periferik yayma incelemelerini yapan herhangi bir laboratuar veya diğer test merkezi bu tip testlere ilişkin Sağlık Bakım Finansman Kurumu (HCFA) yönetmeliklerinin tümüne uymalıdır; bunlara kalite kontrol ve uzmanlık testi programlarına katılım dahildir. Ayrıca, HCFA tüm personel için yeterlilik testini şart koşmaktadır.  

Birçok birinci basamak uzmanlarının temsilcilerini içeren bir komite toplantısında yazarlar yorumun “uygun eğitim ve deneyime sahip bir hekim” tarafından yapılması gerektiğini belirtip şu ifadeyi ekliyorlar: “Hekim sayısal ve morfolojik bulgular belirli bir klinik zemindeki konuyla ilgili diğer bilgiler ile birleştirir.” Ançak deneyime sahip olduğu kabul edilen ve hastanın klinik bakımında yer alan hekimlerin uzmanlık veya uzmanlıklarına değinilmemektedir. Birinci basamak uzmanlar artık uzman görüşleri bildirmek için gerekli deneyim ve eğitim şartlarını karşılamamaktadır. Tıp fakültelerinde yayma morfolojisi eğitimi olmadığından ve asistanlık programları yayma yorumlanmasında örneğin röntgen veya EKG yorumu ile aynı düzeyde eğitim vermemektedir.

Günümüzde hematoloji laboratuarında yaymalar teknisyenler tarafından gözden geçirilmekte  klinisyenler yaymaları gözden geçirmemekte ve  hatta teşvik edilmemektedir; bunun  sonucu, birinci basamak uzmanlarının yayma yorumlamalarına duyulan  güven azalmakdatır. Hatta aslında birçoğu laboratuar bulgularını tanı sürecine uygulama konusunda bile zorluk yaşamaktadır.

Hematologlar ve laboratuar uzmanları için eğitim ve devam eden deneyim klinik ilgi ve günlük çalışmaya bağlı olarak son derece değişken olabilir. Alt uzmanlıklar giderek daha da alt uzmanlık konularında uzmanlaştıkça  yeterlilik için günlük gereken sayıda konu materyaliyle  karşılaşılarak kolaylıkla ortadan kalkabilir. Otomasyon ve yeni teknoloji yayma ve kemik iliği morfolojisinin rolünü giderek azaltmaktadır. Örneğin, akış sitometri hücre fenotiplemesiyle lenfosit morfolojisinin nüansları konusu üzerinde ne kadar durulabilir?

Şu anda zorluk tanı sürecini desteklemek için tüm klinik ve laboratuar bilgilerinin nasıl birleştirileceğidir. Uzman veya hematolog hastanın tanı ve tedavisi için gereken klinik bulgularda anahtar rol oynar ancak laboratuar konusunda söyleyeceği çok az şey vardır. Klinik patolog klinikten/hasta yatağından uzaklaştırılmıştır ve klinisyenin sağladığı çok az klinik veriye dayanmaktadır. Bunun cevabı eski kültüre geri dönmekte yatıyor gibi görünmektedir: laboratuar uzmanı  ile görüşmek üzere klinisyen laboratuara rutin ziyaretlerde bulunmalı, mikroskobun başına oturmalı ve olguları hem klinik hem de laboratuar perspektifinden gözden geçirmelidirler. Bu tip bir etkileşim olmadan hatalı tanı, yanlış tedavi veya en azından ek laboratuar analizlerini doğru şekilde planlamada başarısızlık riski sözkonusudur.

 

3.5.7. Periferik Yaymada İzlenilecek Yollar

 

Kan hücre incelemesi genellikle otomatik hematoloji cihazlarından başlayarak ardışık sırayla yapılır. Kantitatif ve/veya kalitatif anormallikler saptandığında örnekler ek analiz için seçilir. Kantitatif anormallikler hücre sayısı veya şeklinde sınırların dışında kalan değerleri veya cihazın yaptığı lökosit alt tip sayımındaki anormal değerleri içerir. Kalitatif anormallikler bazı sonuçların yanlış olabildiğini veya anormal hücre tiplerinin var olabildiğini gösteren alarm işaretlerini içerir. Bazıları klinik koşullarda beklenen değişiklikleri yansıtır; örneğin, yenidoğana karşı geriatrik hasta, hastanede yatan hastaya karşılık poliklinik hastası, travmaya karşılık transplantasyon hastası. Diğerleri klinik dikkat gerektiren tıbbi durumları gösterir.

Otomatik kan sayım sitemlerinde önemli bir konuda analizörlerin yalancı pozitif ve yalancı negatif sonuçlar vermesidir. Yalancı anormal sonuçlar tanımlanabilir ve ek, gereksiz testleri ortadan kaldırır. Önemli olan konu, bir otomatik analizöründen elde edilen normal bir sonucun kalıtsal veya edinsel hematolojik ya da başka bir hastalık olasılığını dışlamamasıdır. Bunlar laboratuarların ve diğer test merkezlerinin formel periferik yayma gözden geçirmesi prosedürlerine uymalarının diğer iki nedenidir.

Otomatik sayan cihazların tümü lökosit alt tiplerini hassas ve etkin biçimde incelenmesini sağlar ancak bazı durumlarda cihaz işaretleri teknisyenin gözden geçirmesi gerekebilir. Cihaz işaretleriyle ilgili kaygılar nedeniyle, her laboratuar kendi periferik yayma inceleme kriterleri için  bir politika belirlemelidir. Payne tarafından önerilen periferik yayma inceleme kriterleri Tablo 24’de gösterilmiştir(228).

 

 

 

 

 

Tablo 24. Periferik yayma inceleme kriterleri için  önerilen alt  ve üst sınırlar

 

Değişken            

Alt Sınır

 Üst Sınır

 

Lenfositler (x109/L)     

<1.0                                               

>                       >50

 

Eritrositler (x1012/L)     

< 2.0

>8.0                  >8

 

Hemoglobin (g/L)

<50

        >200

 

MCV(fL)

<60

        >110

 

MCH(pg)

<20

        >37

 

MCHC(%)

<25

        >37

 

RDW (%)

 

        >20

 

Trombosit (x109/L) *    

<40

       >1000

 

 

          Veriler   Payne BA, et al.Am J Clin Pathol 1987; 88:51-57 alınmıştır. Trombosit Histogramının bazal seviyesine dönmemesi ve trombosit sonucu alınamaması durumunda  mutlaka periferik yayma  değerlendirilmesi yapılmalıdır.

 

Kan sayım cihazlarında lökosit alt tip sayımı yapan laboratuarların çoğu sayımların kabul mü edeceğini yoksa periferik kan yayması ile tarama mı yapacağını veya manuel sayım yapılarak doğrulanması mı gerektiğini belirleyen CBC ve förmül sonuçlarına dayanan prosedür limitlerine sahip olmalıdır(228).

Hiyerarşik sistemler test merkezleri arasında farklılık gösterir ve test personelinin deneyim ve eğitimini, otomatik analizörlerin gelişmişlik düzeyini ve belirli bir popülasyonda varyasyonların/anormalliklerin insidansını yansıtacak şekilde yapılandırılır. Bu tip hiyerarşik sistemler hangi kalitatif ve/veya kantitatif anormalliklerin periferik yaymanın mikroskopla kimin tarafından gözden geçirilmesi gerektirdiğini ortaya koyar . Anormallikler sıradışı, nadir veya tanı ve/veya tedavi için potansiyel olarak anlamlı olduğunda bir uzman yaymayı gözden geçirebilir.

Laboratuar sonuçlarının kalitesini artıran ve hasta bakımını iyileştiren, deneyimli uzmanın klinik bilgileri rakamsal ve/veya morfolojik anormallikler ile birleştirebilmesidir.

 

 

 

 

 

3.5.8. Periferik Yaymanın  Klinikte Kullanımı

 

 

Periferik yaymanın incelenmesi ve açıklayıcı bir raporun yayınlanması sitoloji laboratuarlarındaki standart labortauvar uygulamaları ile benzerdir. Önce kalifiye bir teknisyen ön tarama yapar ve daha sonra yeterli eğitim ve deneyime sahip uzman tarafından lamlar gözden geçirilir. Her laboratuar hangi lamların uzman tarafından gözden geçirilmesi gerekliliğini belirleyen  kriterler ortaya koymalıdır(228). Periferik yaymalara bakan uzmanlar sayısal ve morfolojik bulguları belirli bir klinik zeminde diğer bilgiler ile birleştirebilmelidir(229).

 

  • Periferik yayma gözden geçirilmesiyle çeşitli hematolojik ve diğer hastalıkların tanısı daha hızlı ve doğru konulabilir. Bunlar enfeksiyöz, konjenital ve edinsel bozuklukları ve maliniteyi içerir.
  • Periferik yaymadaki spesifik bulgular ek testleri yönlendirebilir ve gereksiz testleri ortadan kaldırabilir. Örneğin, önceden anemi teşhisi koyulan bir hastada eritrosit aglütinasyonunun saptanması muhtemel bir otoimmün hemolitik sürecin tanımlanması için ek çalışmaların yapılmasını gerektirebilir. Eritrosit  bulgusu rulo ise, ek çalışmalar myeloma gibi plazma hücre diskrazisine yönelik olacaktır. Benzer şekilde, fragmanlı eritrosit bulgusu mikroanjiyopatik hemolitik süreç, daha şiddetli megaloblastik anemi veya daha benign bir bozukluğu gösterebilir.
  • Periferik yayma bulguları farklı bir tedavi seçeneği gerektiren kuşkuya yer bırakmayan bir tanı ortaya koyabilir. Löseminin lenfoid yerine miyeloid olarak sınıflanması ve paraziteminin Babesia türü yerine Plasmodium enfeksiyonu olarak sınıflanması gibi iki örnek verilebilir.
  • Bazı olgularda tanıya gidilebilir ancak ek doğrulayıcı çalışmalar gerekir. Örneğin, erişkin bir hastada çekirdekli eritrositlerin varlığı aşağıdakilerden herhangi birini gösterebilir: yakın tarihte anlamlı kan kaybı, hemolitik süreç (konjenital (talasemi) veya edinsel (ciddi ısı hasarı), miyelodisplazi ve eritrolösemi. Eritrositlerde bazofilik noktalar eritropoezde bozulmayı gösterir. Bu bulgu çekirdekli eritrositler için listelenen tıbbi durumların herhangi birini gösterebilir ancak bir çocukta kurşun zehirlenmesi düşünülebilir. Bu eritrosit bulgularından herhangi birine sahip hastaya en iyi hizmet, bilgili laboratuar uzmanının laboratuar ve klinik bilgileri birleştirilmesiyle verilir.
  • Nihai klinik tanı ne olursa olsun, uygun ek çalışmalar başlatılabilir ve gerekirse tedaviye derhal başlanır .
  • Bazı olgularda hospitalizasyon en aza indirilebilir veya ortadan kaldırılabilir. Ayrıca maliyetler azaltılabilir, birinci basamak hekimin zamanı daha verimli kullanılabilir ve hastaya daha çok vakit ayırabilir.

 

Periferik yayma gözden geçirmesinin tanıda ve sonraki tetkiklerin yönlendirilmesinde önemli bir basamak olarak kabul edilmesine rağmen, deneyimli uzmanların yorumlarının katkılarının olduğu literatürler sınırlıdır. 1970-1999 yılları arasında yapılan medline taramaları genellikle  demir eksikliği anemisi, periferik kan yayması, tıp ekonomisi, hematoloji cihazları, kalite yönetimi ve klinik sonuçlar terimlerini içeren çok spesifik konulardı. Bu literatürler analizör sonuçlarını  periferik yayma yorumları ile klinik konular bakımından karşılaştırdı. Ayrıca bu literatürler klinik sonuçları bugünkü anlamında nadiren ele aldı.  Periferik yaymayı ne zaman ve neden gözden geçirmeli? Tek bir kriterler kümesi evrensel olamaz ve bu tip bir küme ekonomik açıdan kullanışlı veya akılcı olamaz. Herhangi bir kriterler kümesinin istatistikçileri, tedavi giderlerini karşılayan kurumları ve yasal yetkilileri tatmin etmesi de mümkün değildir. Daha da önemlisi, hasta popülasyonlarında ve test personelinin özellikleri konusundaki farklılıklar tek tip kriterler topluluğunun tanımlanmasını imkansız hale getirir. Periferik yayma gözden geçirmesi için hangi kriterlerin benimseneceği laboratuar direktörü  uzmanının tıbbi görüşünü gerektirir. Ancak hastanın çıkarları ile zamanı giderek daha da azalan birinci basamak hekimin ile aynı olmalıdır. Dolayısıyla bu karmaşık konuları çözmek  sağlık-bakım finansmanının güncel durumu ve değişkenliği göz önüne alındığında, bu uygulamaya geçmek  zor olabilir. Aşağıdaki iki tabloda çeşitli laboratuarlarda ve uygulamalarda elde edilen deneyimler, otomatik analizörlerin ve her düzeydeki tıp personelinin becerileri ile ilgili uzman bilgilerini, yasal yetkilileri, sigorta kuruluşlarını, yönlendirilmiş bakım organizasyonlarını, birinci basamak hekimleri ve en önemlisi hastaların kendilerini ilgilendiren konuları  yansıtmaktadır.

Periferik yaymanın gözden geçirilmesinin majör nedenlerini Tablo 25’de listelenmektedir. Bu tip bir gözden geçirme otomatik hücre sayımlarındaki kantitatif veya kalitatif anormallikler nedeniyle başlatılabilir. Uygun olduğunda,  periferik yayma gözden geçirmesi daha doğru ve hızlı tanı koyulmasını sağlayabilir. Laboratuar sonuçlarının kalitesini artıran ve hasta bakımını iyileştiren, deneyimli uzmanların klinik bilgileri rakamsal ve/veya morfolojik anormallikler ile birleştirebilmesidir. Ayrıca, fiziksel bulgular ve ayırıcı tanı gibi klinik konular önemli olduğundan, hastalardan doğrudan sorumlu hekimler Tablo 25’de listelenen hastalıklar için bir olasılık sözkonusu olduğunda uzman tarafından yapılan periferik yayma gözden geçirmesi istenmelidir. Periferik yayma gözden geçirmesi yapıldığında açıklayıcı rapor hazırlanmalıdır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tablo 25. Periferik Yayma Gözden Geçirme  Nedenleri

 

Kantitatif:

  • Trombosit sayımının doğruluğunu değerlendirmek
  • Analizör tarafından elde edilen alt tip sayımları yoksa veya geçersiz ise lökosit popülasyonlarının değerlendirilmesi veya doğrulanması
  • Hatalı sonuçlardan kuşkulanılıyorsa analizör sonuçlarının doğruluğunu kontrol etmek

 

Kalitatif:

  • Hematolojik malinite tanısı koymak: akut veya kronik lösemi
  • Hematolojik kök hücre hastalığına tanı koymak
  • Kronik miyeloproliferatif bozukluklar
  • Miyelodisplazi, primer veya sekonder (tedaviye bağlı)
  • Kalıtsal lökosit hastalığına tanı koymak (örn., May-Hegglin anomalisi)

 

Hem kantitatif hem de kalitatif:

  • Sitopenilerin değerlendirilmesi
  • Edinsel anemiler (örn. Hemoliz, karaciğer hastalıkları, kombine anemiler)
  • Edinsel trombositopeniler (örn. Disemine intravasküler koagülopati, trombotik trombositopenik purpura)
  • Paroksismal noktürnal hemoglobinüri
  • Plazma hücresi diskrazileri
  • Kalıtsal trombosit hastalıkları (örn., gri trombosit sendromu)
  • Kalıtsal hemolitik bozuklukların değerlendirilmesi
  • Hemoglobinopatiler, talasemiler (örn., Hb SS, beta-talasemi)
  • Enzim eksiklikleri (örn., G6PD eksikliği)
  • Membran defektleri (örn., kalıtsal sferositoz)
  • Enfeksiyöz ajanların varlığını değerlendirmek (örn., malarya, Borrelia)
  • Lenfoproliferatif bozuklukları sınıflamak (enfeksiyöz veya malign)

 Veriler Physician review of the Peripheral Blood Smear: When and Why. Laboratory Hematology 2001; 7: 175-179.alınmıştır.

 

Periferik yayma gözden geçirilmesi ve yapılması gereken durumlar ve/veya bulgular Tablo 26’de listelenmiştir. Mutlak görüş birliğine başlangıçta sadece blastların varlığı konusunda varılmışsa da, en sonunda, analizörler tarafından saptanmayan veya normal sayısal sonuçlar ile maskelenen durumların belirlenmesinde periferik yayma gözden geçirmesinin gerekli olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Otomatik analizör sonuçları Tablo 26’de gösterilen bulguların herhangi biri için işaretlere sahip bir hastada ciddi bir hastalık olabilir. Aynı durum teknisyenin periferik yayma gözden geçirmesinin Tablo 25’de listelenen bulgulardan herhangi biri vermesi için de geçerlidir ve bu hastalıklardan bazıları potansiyel olarak yaşamı çok yakın zamanda tehdit edebilir. Dolayısıyla, periferik yayma gözden geçirmesi tıbbi yönden uygundur çünkü hem klinik bakımının hem de laboratuar çalışmalarının kalitesini artırır. periferik yayma gözden geçirmesi tıbbi yönden endikedir çünkü hastanın tıbbi bakımını iyileştirebilir.

 

Tablo 26. Periferik Yayma Gözden Geçirmesinin Tıbbi Açıdan Endike Olabildiği Bulgular/Durumlar

 

 

İlk gözlem veya olay

 

Anormal hücreler

 

 

Anormal eritrosit indeksleri   /morfolojisi

 

 

 

 

Kan yaymasında görülebilen  mikroorganizmalar için klinik veya diğer kuşku

 

Herhangi bir dizide displastik hücreler

 

Eritrositlerde veya trombositlerde inklüzyonlar

 

Lökositlerde intranükleer ve/veya intrasitoplazmik inklüzyonlar

 

Pansitopeni veya belirgin sitopeni

 

Bulgu veya durumun örnekleri

 

Blast; anormal lenfoid hücreler, lenfositoz, diğer önceden belirlenmiş kriterler (örn., olgunlaşmamış hücreler)

 

Önemli ölçüde azalmış/artmış MCV;

ayaktan tedavi edilen hastada artmış RDW;

nRBC;

rulo, şistositler, sferositler, gözyaşı damlası RBC’ler

 

Malaria, Babesia, Borrelia, C. Perfiringes, ehrlichiosis

 

 

 

Pelger-Huet anomalisi; dev trombositler

 

Hemoglobin C veya diğer kristaller; Howell-Jolly cisimcikleri

 

 

Auer çubuğu, Chediak-Higashi sendromu, HIV veya diğer sistemik enfeksiyon; May-Hegglin anomalisi

 

Gri trombosit sendromu; paroksizmal noktürnal hemoglobinüri

 

 

Sonraki gözlem veya olay

  Bilinen bir hematolojik malinite/kök hücre hastalığı için tedavi edilen bir hastada anormal hücrelerin sürekli varlığı

 

Tedavi altındaki bir hastada enfeksiyöz organizmaların varlığı

 

 

Rezidüel akut lösemi

 

 

 

 

 

Parazitemi düzeyini belgeleme

Burada sunulan durumlar ve bulgular tüm durum/bulguları kapsamamaktadır. Spesifik klinik uygulama ve/veya test merkezi periferik yayma gözden geçirmesi için uygun tıbbi endikasyonları belirleyecektir.

Veriler Physician review of the Peripheral Blood Smear: When and Why. Laboratory Hematology 2001; 7: 175-179’den alınmıştır.

 

 

3.5.9. Periferik Yaymaların Hazırlanması

 

Periferik yaymanın incelenmesi hematolojik değerlendirmenin bir parçasıdır. Elde edilen bilginin güvenilirliği iyi hazırlanmış ve iyi boyanmış yaymalara bağlıdır. Morfolojik değişiklikler ısıya, zamana ve depolamaya bağlı olarak önemli olabildiğinden periferik yayma mümkün olduğunca hemen hazırlanmalıdır. En iyi sonuçlar 2 saat içinde elde edilmektedir. Periferik yaymalar venöz(antikoagüle kan) ve kapiller yoldan alınan kan örneği ile yapılabilir. Antikoagülan olarak K2EDTA  veya K3EDTA, sodyum sitrat ve ACD gibi antikoagülanlar kullanılabilir(230). Heparin genellikle trombositlerin morfolojik yorumlanmasını interefere eder ve kümeleşmeye neden olduğu için tercih edilmez. . Kan yaymaları otomatik hematolojik analizden kalan antikoagüle edilmiş kan örneklerinden de hazırlanabilir. Ancak antikoagülan nedeniyle hücre görünümü ve boyanmasında artefaktlar olabilir. Optimal morfoloji ve boyanma; pıhtılaşmamış kandan ve çoğunlukla da parmak delme prosedüründen elde edilen kandan sağlanır. Hücrelerin  lam veya lamel boyunca mekanik olarak yayılması da hücreleri bozar, ancak bu artefakt doğru teknik ile en aza indirilebilir. Periferik yaymanın hazırlanmasında üç yöntem vardır:

a. Manuel yöntem (lam  ve lamel)

b.Yarı otomatik yöntem (lam, santrifüj )

            c.Otomatik yöntem(lam)

NCCLS(213) periferik kan filmlerinin hazırlanmasında referans yöntem olarak lam (kama) tekniğinin kulllanılması gerektiğini düşünmektedir. Alt komite çalışmaları ile lam yönteminin kabul edilebilirliği de doğrulandı.

 

3.5.9.1. Manuel Yöntem

3.5.9.1.1. Lam Yöntemi (Referans Metot)

 

Kan yaymaları lam yöntemi ile temiz cam lamlar üzerinde de hazırlanabilir. Bu yöntemde 30µL kan lamın yaklaşık olarak ortasına, ucun 1-2 cm gerisine koyulur. İkinci yayıcı lam 30-45 derece açıyla yerleştirilir ve kan damlasıyla temas etmesi için geri itilir. Kan damlası lamın kenarına doğru yayılır; kanın iki lam arasında yayılması ile yayma oluşturulur. Yayıcı lam kan orta incelikte yayma oluşturuncaya kadar orta hızda ileri doğru itilir. Bu teknik 3-4 cm uzunluğunda bir yayma oluşturur. Yayıcı lamın kenarları düzensiz ise veya yayıcı lamın hızı nedeniyle artefakt oluşabilir. Cam lam preparatları filmin kenarlarında daha büyük beyaz hücrelerin birikmesi insidansını artırmış ve hücre dağılım hatalarına yol açmıştır. Yayıcı lamın hızlı hareketi hücre popülasyonunun daha homojen dağılımını sağlar. Yayıcı lam temiz, kuru ve ilk lamdan biraz daha dar olmalıdır; böylece kenarlar mikroskop altında kolayca incelenebilir(41). Lamlar elde sallanarak veya elektrikli kurutucuya tutularak hızla kurutulmalıdır. Yaymanın  kalınlığı yayıcı lamın açısı veya yayma hızı değiştirilerek ya da daha küçük veya daha büyük kan damlası kullanılarak ayarlanabilir. Belirli bir açıda yayıcı lamın itilme hızının arttırılması da yaymanın kalınlığını arttırır. Yayma  lamın tüm yüzeyini kaplamamalıdır. İyi bir yaymada kalın bir kısım, ince bir kısım ve birinden diğerine dereceli geçiş vardır. Yayma  düz, homojen bir görünüm sergilemeli, kırışıklık, çıkıntı veya delik olmamalıdır. Yayıcının kenarı kesinlikle düz olmalıdır. Pürüzlü ise yaymada lökositlerin uçlarında tırtık görülür.

Optimal kalınlıktaki yaymalarda yaymanın büyük kısmında eritrositlerde kümeleşme görülür ancak ince uca doğru eritrosit eşit dağılımı ve daha ince yayılması söz konusudur. Yayma  ortam havasında ne kadar hızlı kurursa, her bir hücre lam üzerinde o kadar iyi yayılır. Yavaş kurutma (örn, nemli havada) hücrelerde kontraksiyon artefaktlarına neden olabilir. Lamın buzlu tarafına veya periferik yaymanın kalın ucuna kurşun kalem ile kimlik bilgileri yazılır. Bu metot  laboratuarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır(230).

3.5.9.1.2. Lamel Yöntemi

 

Lamel yaymaları toz, pamuk lifi ve yağ içermeyen lameller (no.1, ½ inç kare veya 20 x 22 mm) kullanılarak hazırlanır. Bu tip lameller kanın yüzey boyunca optimal yayılmasını ve minimal artefakt sağlar. Genellikle yüksek kaliteli lameller ek temizlik gerektirmez ancak eskimeyle bozulma görülebilir. Plastik ıslatılamayan lameller bu preparatlar için iyi değildir. Yayma lamelin baş parmak ve işaret parmağı arasında iki komşu köşeden tutulmasıyla hazırlanır. Taze veya antikoagüle edilmiş kanın küçük bir damlası lamelin ortasına koyulur. Damla çok büyükse kalın yayma elde edilir. Damla çok küçükse çok ince yayma elde edilir. Daha sonra ikinci bir lamel aynı şekilde diğer elle tutulur ve ilk lamelin üzerine koyulur ve düzgün, hızlı hareketle yavaşça 45 derece açıyla döndürülür. Ardından, iki lamel birbirinden uzağa itilir. Yayılma durduğu anda lamelleri hızla ancak sertçe yüzeylere paralel düzlemde birbirinden ayırılır. Genellikle kan bir lamelde diğerine göre çok daha homojen yayılır. Lameller yayma tarafı yukarı gelecek şekilde temiz bir kağıda koyulur ve ortam havasında kurumaya bırakılır veya mukavva kutudaki bölümlere arka arkaya yerleştirilir(41).

Venöz kandan yapılan yaymalar lamel üzerinde bir damla kan ile benzer şekilde hazırlanır  ve tarif edilen şekilde prosedür uygulanır.  Bu yöntemin enfeksiyon riski lam yöntemine göre yüksektir ve artık kullanılmamaktadır(230).

 

3.5.9.2. Yarı Otomatik Yöntem

3.5.9.2.1.  Santrifüj(Spinner) Yöntemi

 

Periferik yayma hazırlamasında hücrelerin homojen dağılımını yapan otomatik teknikler de geliştirilmiştir. Bu işlemlerde iki tip cihaz kullanılır: santrifüjleme yapan cihazlar ve mekanik olarak kanı yayan cihazlar. Santrifüjleme teknikleri; beyin-omurilik sıvısı gibi sıvılardaki hücrelerin yaymaları hazırlanırken az sayıda hücrenin küçük bir bölgede yoğunlaştırılması gerektiği zaman yararlıdır.  Mekanik yayıcılar manuel tekniği taklit eder ve çok sayıda kan yayması hazırlanırken yararlıdır. Genelde, otomatik tekniklerle hazırlanan yaymalar deneyimli teknisyenin yaymalarına göre daha düşük kalitededir. Bu yöntemin avantajı  homojen bir kan yayma oluşturularak tüm hücreler tek bir tabaka halinde ayrılır ve rastgele dağılır ve lökositler  yaymadaki herhangi bir noktada kolayca görülebilir. Lam yaymalarında  ince kenarın ucunda orantısız monositler, ince sivri ucun hemen gerisinde ve yaymanın yan kenarlarında nötrofiller bulunur. Bu yöntem uygulamada çok kullanılmaz(230-231).

 

3.5.9.3. Otomatik Yöntemlerle Periferik Yayma Yapılması

 

Periferik yayma hematoloji alanında periferik kanın incelenmesinde önemli bir alandır. Periferik yayma işlemi lökosit alt tiplerinin, anormal lökositlerin tanımlanmasını, eritrosit ve trombositlerin incelenmesini içerir. Kan sayım analizörlerinin birçoğu isteğe bağlı olarak otomatik periferik yayma ve boyama yapabilmektedir. Otomatik  periferik yayma(slide maker) ve boyama yapan(slide stainer) sistemler birçok kan sayım cihazına opsiyonel olarak entegre edilebilir. Otomatik slide maker ve stainer sistemlerinin kan sayım cihazlarına entegrasyonuyla periferik yayma işlemlerinin standardizasyonu ve otomasyonu böylece sağlanmış oldu. Bu özellik ile klinik laboratuarlarda  periferik yayma işlemlerinde manuel işlem (yayma ve boyama) basamakları otomatikleşmiş oldu(17,54,171, 232). Beckman Coulter Sistemleri(Coulter GenS, LH 755), Sysmex XE 2100, ABBOTT CellDyn 4000, ABX PENTRA DX 120 ve ADVİA 120’ gibi kan sayım cihazlarına periferik yayma(slide maker) ve lam boyama(slide stainer) modülleri entegre olabilir.Otomatik yayma ve boyama sistemlerinin özellikleri aşağıda kısaca özetlenmiştir.

 

3.5.9.3.1. Otomatik Periferik Yayma Sistemi

                   (Slide Maker)

            Otomatik periferik yayma sistemi(Slide Maker) periferik yayma işlemlerinde standartizasyon getirmekte ve yayma kalitesini arttrmaktadır. Slide maker modülü kan sayım sistemlerinden almış olduğu kan örneğini kullanarak online olarak hızlı ve kolay bir şekilde periferik yayma hazırlamaktadır. Her bir yayma tarih, zaman ve  örnek bilgilerinin bulunduğu barkodlu veya barkodsuz etiket ile tanımlanmaktadır. Bu sistemlerin  yararlı özellikleri aşağıda sunulmuştur(233-234).

  • Kan sayım cihazlarında CBC+Diff+Retikülosit+yayma çalışması tek bir tam kan aspirasyonuyla yapılmaktadır. Yayma işlemi için ayrıca kan gerektirmemektedir.
  • Bu cihaz rutin bakım gerektirmemektedir.
  • Slide maker cihazının kullandığı yayma hazırlama işlemi NCCLS standartlarının tümünü karşılayarak manuel işlemleri azaltmaktadır.
  • Kan örneğinin değişen viskositesine göre yayma otomatik olarak ayarlanabilmektedir.
  • Yüksek kalitede yayma hazırlanmaktadır.

 

3.5.9.3.2. Otomatik Lam Boyama Sistemi

             ( Slide Stainer)

 

Otomatik lam boyama sistemi kan sayım sistemlerini tamamlayıcı opsiyonel bir cihazdır. Slide Stainer modülü kan sayım cihazlarına entegre olduğundan slide maker cihazının hazırlamış olduğu yaymaların boyama işlemini tam otomatik online olarak yapmakta ve mikrospik incelemeye hazır duruma getirmektedir(233-234).

  • Bu sistemler ayrıca elde manuel olarak hazırlanan yaymalarının da( periferik, kemik iliği gibi) boyanabilmesini sağlar. Boyma işleminin sırası ve süresi kullanıcı tarafından proglanabilir.
  • Acil çalışmalar öncelikli yapılabilir.
  • Yayma kururutucusu cihazın üzerinde bulunduğundan  standartizasyon artar.
  • Bu cihazlar Wright, Wright-Giemsa, May Grünwald gibi kullanıcının kendisinin oluşturucağı protokoller ile boyama olanağı sağlar.

 

3.5.10. Periferik Yaymada Kullanılan Boyalar

3.5.10. 1. Referans Boya

 

Periferik yayma çalışmalarında kullanılan anilin boyalar; metilen mavisi gibi bazik boyalar ve eozin gibi asit boyalar olmak üzere iki genel sınıfa ayrılır. Çekirdekler ve kanın diğer belirli yapıları bazik boyalar ile boyanır; dolayısıyla bunlar bazofiliktir. Sadece asit boyalar ile boyanan yapılara asidofilik veya eozinofilik yapılar adı verilir. Bu ikisinin kombinasyonuyla boyanan diğer yapılara nötrofilikler adı verilir(235).

Polikrom metilen mavisi ve eozin boyaları orijinal, zaman alan Romanowsky yönteminin geliştirilmiş halidir ve yaygın biçimde kullanılır. Bunlar kandaki normal ve anormal yapıların çoğunu ayırıcı biçimde boyarlar.  ICSH, Romanowsky boyamasını referans yöntem olarak kabul etmektedir(119). Romanowsky boyası metilen mavisi ve/veya onun oksidasyon ürünlerini (azur B) içeren herhangi bir boya ve halojenli floresan boyadır (genellikle eozin B veya Y). Metilen mavisi(tetrametiltiyonin) tiazinin temel bileşenleri ve onun oksidatif demetilasyon ile oluşan analoglarının değişken oranlarını içerir: Bunlar azur B (trimetiltiyonin), azur A (asimetrik dimetil tiyonin), simetrik dimetiltiyonin ve azur C (monometiltiyonin)dir. Asidik bileşen eozin ksanten iskeletinden elde edilir.

Referans alt tip sayım preparatları Romanowsky boyası ile boyanmayı gerektirir. Hücre unsurlarının optimal boyanması hem olgun hem de olgunlaşmamış lökositlerin ve ayrıca anormal hücrelerin doğru tanımlanmasına yardımcı olur. Başarılı boyalar :

·       Romanowsky etkisini tutarlı olarak yaratır; bu, önceden belirtilen boyaların kombine etkisiyle uygun pH’da (6.4- 7.0) belirli hücre bileşenlerini tipik olarak boyar. Bu hücre bileşenleri lökosit çekirdekleri ve nötrofile spesifik granülleri içerir.

·       Başarılı boyalar diğer hücre bileşenlerine  karakteristik renkleri (tipik olarak maviler ve pembeler) kazandırır:

·       Lökosit iyi korunmuş olmalıdır ve aşırı vakuolleşme veya çekirdek şeklinde değişiklikler gibi antikoagülan etkileri minimal olmalıdır.

·       Bazı lenfoproliferatif bozukluklar dışında lökositlerin %2’den azı bulaşmış olabilir. Granülositik, monositik, lenfositik ve diğer hücrelerde tekrarlanabilir boyama olmalı ve çekirdek-sitoplazma ayrımı belirgin, çekirdek kromatin paternleri ayrı ve sitoplazmik renk farkları belirgin olmalıdır(210).

 Romanowsky boyalarının çoğu metil alkolde çözdürülür ve fiksasyon ile boyamayı birleştirir. En iyi bilinenler arasında Giemsa ve Wright boyaları yer alır.

 

Wright Boyası: Bu boya eozin ve tiazinlerin kompleks bir karışımını; genellikle  %50-75 metilen mavisi ve azur B (diğer türevler  %10-25) içeren metil alkolik bir solüsyondur(244). Biyolojik Boyalar Komisyonu tarafından tescillenen Wright boyası kullanıma hazır solüsyon veya toz olarak piyasada bulunur. Wright boyasıyla iyi boyanan yaymalar çıplak gözle bakıldığında pembe renktedir. İncelendiğinde hücreler eşit dağılmış görünmelidir.

  • Eritrositler limon sarısı veya kırmızı değil, pembe olmalıdır. Minimum çökelti olmalıdır. Kan hücreleri vakuol gibi artefaktlar içermemelidir.
  • Lökositlerin çekirdekleri mordur, kromatin ve parakromatin kolayca ayırt edilir ve sitoplazmik nötrofilik granüller ten rengidir.
  • Eozinofilik granüller kırmızı-turuncu renktedir ve her biri ayrı ayrı görülebilir. Bazofil koyu mor granüllere sahiptir.
  • Trombositler koyu lila granüllere sahiptir. Varsa bakteriler mavi görünür.
  • Lenfositlerin sitoplazması genelde açık mavidir; monositlerinki ise açık mavi-gri renktedir. Malarya parazitleri gök mavisi renkte sitoplazma ve kırmızı-mor kromatine sahiptir.

Wright boyası sölüsyonu: 3 gram toz Wright Boyası 100 ml absolü metanolde çözülür. İyice kapatılarak oda ısısında 24 saat bekletilir. Süzülerek kullanılır(236).

Sörensen’s tampon solüsyonu hazırlamak için(pH 6.4);  primer (monobazik) potasyum fosfat (KH2PO4) anhidr 6.63 g; sekonder (dibazik) sodyum fosfat (Na2HPO4), anhidr 2.56 gram tartılarak distile suyla bir litreye tamamlanır. Daha alkali bir solüsyon (pH 6.7) 5.13 g potasyum tuzu ve 4.12 sodyum tuzu kullanılarak hazırlanabilir.

Metot:

1.Yaymalar metonol ile fikse edilir.

2. Yaymalar yan eğitilerek metanol uzaklaştırılır.

3. Yatay pozisyondaki lamın üzerine boya dökülür ve 2 dakika beklenir.

4.Çalışılan lamın üzerindeki boya yatay lamdan uzaklaştırılmadan eşit miktarda tampon solüsyon dikkatle eklenir ve yavaşça üflenerek karıştırılır.

5. 3 dakika beklenir.

6. Lam distile suyla 30 saniye yıkanır.

7. Yatay pozisyonda lam kurutulur. Kurutma kağıdı ile kurutma yapılmamalıdır.

8. Gerekirse  üzeri kapatılır.

Ayrıca  Maile, J.B.in 1967’nin önerdiği boya karışımı da hazırlanabilir. Bu boya karışı T Yüksek İhtisas Hastanesi Hematoloji Laboratuvarında kullanılmaktadır. Bu boya karışımı için  9 gram toz Wright boyası, 1.0 gram toz Giemsa boyası, 90 ml Gliserin  2910 ml anhidr ve asetonsuz Metanolde çözülür. Kahverengi bir şişeye konulur ve sıkıca kapatılarak kullanılır. Gerekirse çalışma sırasında süzülebilir(ayrıntılı bilgi Yüksek İhtisasHastanesin’den alınabilir).

 

Diğer Boyalar: Bu boyalarGiemsa, Leishman, May-Grünwald, MacNeal boyalarıdır. Ayrıca Wright-Giemsa, May-Grünwald-Giemsa gibi birçok boyanın çeşitli kombinasyonları da bulunmaktadır. Bazıları belirli amaçlar için özellikle önerilmektedir; örneğin, Giemsa boyası malarya parazitleri ve protozoaların boyanması için mükemmeldir(237).

 

3.5.10.2. Periferik Yaymaların Rutin Boyanması

 

Kan yaymaları genellikle Wright veya May-Grünwald-Giemsa boyaları ile boyanır. Her iki boya Romanowsky prosedürlerinin modifikasyonlarıdır. Bazik boya metilen mavisi ve eozinden formüle edilir. Wright boya formülasyonu metilen mavisini hücreyi boyayan metilen azüre dönüştürmek için sodyum bikarbonat kullanır. Giemsa boyaları dönüşmüş azur bileşiklerini elde etmek için bilinen miktarlarda asit bikromat kullanır. Tüm Romanowsky boya tipleri suda çözünmez niteliktedir ancak metil alkolde çözünürler. Boya su içermemelidir; su kırmızı kan hücre artefaktlarına yol açar. Su artefaktları lamların veya lamellerin boyamadan önce anhidr metanol içerisinde fikse edilmesiyle önlenebilir.

Optimal boyama koşulları her yeni boya serisinden önce belirlenmelidir. Metilen mavisinin azur bileşiklerine dönüşümü boya şişedeyken devam eder; dolayısıyla boyama koşulları zaman içerisinde değişebilir. Metil azurler bazik boyalardır ve hücrenin asidik yapılarına (nükleik asitler ve proteinler) bağlandıklarında leylak-mavi renk verirler. Eozin hücrenin bazik yapılarıyla etkileşir ve sitoplazma bileşenlerine ve hemoglobine kırmızımsı ton verir. Doğru boyanan  lam pembe tonludur. Eritrositler turuncu-pembe renge ve lökositler morumsu-mavi çekirdeklere sahip olmalıdır. Romanowsky boyaları lökosit granüllerini ayırıcı biçimde boyarlar ve hücrelerin morfolojik analizine yardımcı olur. Dolayısıyla nötrofil granülleri hafifçe baziktir ve azurofilik bileşen ile zayıf boyanır. Eozinofiller güçlü bazik bir spermin türevi içerir ve eozin ile boyanırlar. Buna karşılık bazofil granüller ağırlıklı olarak asidik proteinler içerir ve koyu mavi-leylak renkte boyanırlar. Hücrelerin üzerinde çökelti olmamalıdır çünkü bu lamların veya lamellerin iyi temizlenmediğini gösterir. Lamların üzerinde toz da artefakta neden olur. Boya solüsyonları çok fazla kullanıldıkları zaman süzülmeli veya haftada bir kez değiştirilmelidir.

Aşırı Mavi Boyanma. Bazen hücrelerde aşırı mavi renklenme görülür. Bu, çok uzun boyama sürelerinden, eskimiş ya da yanlış hazırlanmış tamponun çok alkali hale gelmesinden, eski kan yaymalarından, çok kalın kan yaymalardan  veya boya ya da seyrelticinin alkalitesinin çok yüksek olmasından kaynaklanır. Bu tip yaymalarda eritrositler mavi veya yeşil görünür, nükleer kromatin koyu mavi-siyah ve nötrofillerin granülleri derinlemesine boyanmış ve büyük ve çarpıcı görünür. Eozinofillerin granülleri mavi veya gridir. Daha kısa süreli boyama veya daha az boya ve daha çok seyreltici kullanımı ile problemi düzeltilebilir. Bu basamaklar etkisiz kalırsa, tampon çok alkali olabilir ve pH’ı daha düşük yeni bir tampon hazırlanmalıdır.   Boyamanın kalitesi distile su ile hızla ve yoğun durulama ile artırılabilir. Lamda hücreler arasındaki bölgeler boyanırsa, bu genellikle lamın yetersiz yıkandığını, heparin antikoagülasyonunu veya muhtemel paraproteinemiyi gösterir.Kalın yaymalar, uzun boyama süresi, yetersiz yıkama veya boya ya da seyrelticinin alkalitesinin çok yüksek olması aşırı bazofiliye neden olabilir.

Aşırı Pembe Boyanma Boyama çok pembe veya kırmızı görünürse, genellikle problem çok asidik tampondur. Bu, soluk boyanmış lökosit çekirdeklerine, çok fazla turuncu-kırmızı kan hücrelerine ve parlak kırmızı eozinofil granüllerine yol açar. Aşırı kırmızı rengin diğer nedenleri yetersiz boyama süreleri ve lamın aşırı yıkanması, lamellerin kurumadan önce koyulması veya boya ya da tamponun asiditesinin çok yüksek olmasından kaynaklanır. Çoğunlukla, boyama problemleri solüsyonların pH’ındaki problemlerden kaynaklanır ve yeni tamponlar sorunu giderir. Bu tip yaymalarda eritrositler parlak kırmızı veya turuncu, nükleer kromatin açık mavi ve eozinofillerin granülleri parlak kırmızı renktedir. Asidite artışının nedenlerinden biri boya veya tamponun asit gazlarına maruz kalmasıdır. Problem tamponun düşük pH’ı veya metil alkol olabilir; metil alkol bekleme sırasında oksidasyon sonucunda formik asit geliştirmeye eğilimlidir(236).

Diğer Boyama Problemleri. Yetersiz boyanmış eritrositler, çekirdekler veya eozinofilik granüller olması gerekenden az boyama veya aşırı yıkamaya bağlı olabilir. Boyama süresinin uzatılması veya yıkamanın azaltılması bu sorunu ortadan kaldırabilir. Yayma  üzerinde çökelti, temiz olmayan lamlar, boyama süresince kuruma, lamın boyama döneminin sonunda yetersiz yıkanması ve özellikle de ilk yıkama sırasında lamın yatay şekilde tutulması, boyanın yetersiz filtrasyonu veya tozun lam veya yaymanın üzerine çökmesinden kaynaklanabilir.

 

3.5.11. Periferik Yayma Yapılırken Dikkat Edilecek Noktalar

 

Periferik yayma hazırlama ve ve boyamaya ilişkin kılavuzlar pek çok laboratuar ve hematoloji ders kitaplarında bulunmaktadır ve yakın zamanlarda  gözden geçirilmiştir (213,). İyi hazırlanmış ve boyanmış bir periferik yayma  kan hücrelerinin kaliteli morfolojik analizi için şarttır. Türkiye’de  periferik yayma   hazırlama için en sık kullanılan yöntem Wright veya Wright-Giemsa boyamasıyla lam yöntemidir. May-Grünwald-Giemsa tipi boyama Avrupa’da ve diğer ülkelerde daha popülerdir. Hücrelerin yüksek kalitede tanımlanması için periferik yaymanın  morfolojik analize uygun bölgesinin kullanılması gerekir çünkü periferik yaymanın  bir kısmı kalın, bir kısmı ince olacaktır. Tüm hücrelerin temsili sayımı için, incelenen bölgenin tam genişliğini kapsamak gerekir çünkü lökositler cam yüzey üzerinde eşit dağılmazlar. Monositler ve nötrofiller gibi büyük hücreler periferik yaymanın ucuna (“ince uç”) ve yanlara doğru itilirler. Dolayısıyla periferik yaymanın   yan tarafları incelemeye dahil edilmediğinde hücre alt tipleri doğru şekilde sayılmayabilir. İzleme taraması bu tip problemleri önler ve aynı zamanda aynı hücrelerin tekrar  analizini önler.

Periferik yaymayla analiz edilen hücrelerinin tüm tipleri için aşağıdakilerin geçerli olduğunu bilmek önemlidir.

·       Hücrelerin lama uygulanma işlemi (yayma, smear, döndürme) hücrelerin görünüm ve dağılımlarında değişikliğe yol açabilir.

·       İkincisi, hücreler havayla temas ederek kuruduklarında orijinal küremsi görünümlerini kaybedip düzleşirler.

·       Son olarak, hücrelerin içerikleri fiksasyon ve ardından boyama nedeniyle değişikliğe uğrarlar. Dolayısıyla fikse edilip boyanmış kan hücrelerinin morfolojik analizleri çok sayıda artefakt içerir ve süspansiyon içerisindeki işlemden geçirilmemiş canlı hücreler ile doğrudan karşılaştırma herzaman mümkün olmayabilir veya çok iyi olmaz. Tipik bir örnek kronik lenfositik lösemili hastaların kırılgan lenfositlerinde görülür; bunlar kan hücrelerinin lamlara uygulanmasında kullanılan yöntemler ile genellikle tanınamayacak kadar hasar görürler.

Optimal sonuçlar periferik yayma hemen hazırlanıp tamamıyle kurutulduktan sonra hemen fikse edilerek boyanmasıyla elde edilir. Boyamadan önce periferik yaymanın fikse edilmesi önerilmektedir(236). Birçok laboratuar  periferik yayma kurutuldıktan sonra pratik olduğu için hemen boyama yapmaktadır. Bu prosedür genellikle kabul edilebilir . Ançak  periferik yaymalar hemen boyanmazsa, metanol ile fiksasyon 4 saat içinde yapılmalıdır. Laboratuarlarda genellikle lamlar kuruduktan sonra bir saat sonrası tercih edilir. Aksi halde yaymada  arka plan gri/mavi renk olacaktır. Boyama ve fiksasyon solusyonları morfolojik artefaktları önlemek için su içermemelidir(%3). Manuel boyanma işleminde kullanılan lamlar coplin kavanozlar içine daldırılmalıdır. Lamların düz bir zeminde boya solusyonu ile kaplanması yöntemi; buharlaşmadan dolayı çökelti oluştuğu için bu yöntem tercih edilmemelidir. Sıcak havalarda boyama işlemi sırasında buharlaşmayı önlemek için mutlaka kapalı kavanoz ve petri kutusu tercih edilmelidir. Otomatik boyama cihazları spesifik boyama prosedürleri gerektirir ve kullanıcılar gereksinimlerine ve  hücre boyanmasına göre değişik modifikasyonlar yapabilir.

Boyama protokolleri laboratuarlar arasında oldukça değişkendir. Boyama ve boyama sonuçları için izlenecek yollar hematoloji  kitaplarında bulunabilir. ICSH  periferik yaymalar için referans boyama metodu için saf eosin Y ve azure B içeren solusyonları önermektedir. Periferik yaymaların kalitesi için genel kural boyama işlemininin kan yaymlarındaki bütün hücre tiplerini tanımlayacak şekilde olmasıdır. Bu hem manuel hemde otomatik yöntemler için geçerlidir. Periferik yaymalar tipik olarak romanowsky boyalarla boyanır ve bu boyalar değişk oranlarda thiazin ve eozin içermektedir. Değişik metodlar tanımlanmıştır. Wright, Wright-Giemsa, May-Grünwald-Giemsa ve Leishman boyası gibi. Boya ve fiksasyon için kullanılan malzemeler oda ısında ağzı sıkıca kapalı şekilde muhafaza edilmelidir. Romanowsky boyalar soğukta bozulabilir. Romanowsky boyalar karsinojenktir, deri ve mukoza ile temasdan kaçınılmalıdır. Romanowsky boyalarla boyanmış hücrelerin inefektif olduğu varsayılmaktadır. Genellikle tam boyanmış periferik lamların zararlı etkisi yoktur. Ançak metanol ile fiksasyon işlemi HIV , hepatit B ye karşı ve prionların neden olduğu diğer enfeksiyon tiplerine koruyuculuk sağlamamaktadır. Romanowsky boyalar, methanol, alkol, aseton, ksilol, toluen gibi maddeler oldukça yanıcıdır güvenli kabinlerde saklanması gereklidir. Lamlar uzun süre saklanacaksa ışıktan uzak tutulmalıdır(236).

 

 

 

3.5.12. Periferik Yayma’nın Değerlendirilmesi

3.5.12.1. Kan Hücrelerinin Morfolojik Analizi

 

İyi hazırlanmış bir kan yaymasının dikkatle incelenmesi hematolojik hastalık değerlendirmesinin önemli bir parçasıdır. Otomatik hematoloji analizöründen elde edilen veriler ile spesifik tanı koyulsa da, pek çok hastalıkta kan sayıları normal ancak hücre morfolojisi anormaldir. Periferik kan yayma incelemelerinde görülebilen ve spesifik hastalık durumları ile ilişkili olan eritrositlerin anormal örnekleri Tablo 27’de yer almaktadır(Şekil 35). Ancak morfolojik analiz kötü hazırlanan veya kötü boyanmış kan yaymaları nedeniyle büyük ölçüde aksayabilir. Tatmin edici kan yaymalarının hazırlanması kan yaymasının hazırlanması ve boyama tekniklerine özellikle dikkat edilmesini ve normal ve patolojik hücre tiplerinin morfolojik görünümleri Şekil 49’da detaylı olarak gösterilmiştir(235, 238).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

D

B

A

A. Normal Eritrosit

 

C

B. Mikro/Hipokrom

C. Makro

D. Target

E. Sferosit

 

H

G

E

F. Heinz Cisimcikleri

 

F

G. Şiştozit

H. Çekidekli Eritrositler

I. Polikormazi

J. Gözyaşı Hücresi

 

 

       
 

I

 

J

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 49. Periferik Yaymanın Normal, Renk Değerlendirilmesi İnklüzyon Cisimcikleri ve Pokilisitoz Yapan Durumlar

 

Periferik  yayma üzerinde eritrositlerin kantitatif anormalliklerini değerlendirmek zordur; ancak eritrositler büyüklük, şekil ve hemoglobin dağılımındaki değişiklikler ve hücre inklüzyonlarının varlığı açısından değerlendirilmelidir(Tablo 27). Periferik yaymada eritrositmorfolojisi incelenirken; normal ve anormal bulgular not edilir.

Normal bulgular:

         a.   Normositik: normal hücre büyüklüğü ve şekline göre(Şekil 34/A)

a.      Normokromik: normal hemoglobin içeriği ve rengine göre

 Anormal Bulgular:

a.      Spesifik terimlere göre

b.     Anormalliklerin ayırt edilme derecesine göre not edilmelidir.

 (Hafif(+): 1-5 hücre/10 alanda, Orta(++): 6-15 hücre/ 10 alanda,  Belirgin(+++): > 15 hücre/ 10 alanda)

Eritrositler  genellikle yayma boyunca eşit dağılmazlar(239). Optimal eritrosit morfolojisi, eritrositlerin birbirine yakın olduğu ancak örtüşmediği yayma bölgesinde görülür. Eritrositlerin çok ince veya kalın yayıldığı bölgelerde artefaktlar artar. Bazı kan yaymalarında eritrositler birbirine yapışık görünür ve eritrosit kümeleri oluşur; buna rulolar adı verilir. Bu bulgu eritrositlerin birbirine çok yakın olduğu yayma bölgelerinde normal hastalarda da görülebilir. Ancak ruloların yaymanın daha ince bölgelerinde de görülmesi eritrositi kaplayan ve eritrositler arasında normal elektrostatik itme kaybına bağlı aglütinasyona neden olan paraproteinin varlığını gösterir. Eritrositler  büyüklük ve şekil bakımından aynı olmalıdır ve ortalama çapları 7.2 -7.9 mikrometredir. Bu, bir mikrometre kullanılarak ya da daha küçük bir lenfositin (aynı büyüklükte veya biraz daha küçük) çapıyla karşılaştırılarak değerlendirilebilir. Eritrosit  büyüklüğündeki farklılığa anizositoz adı verilir. 9 mikrometreden büyük ve iyi hemoglobinlenmiş hücrelere makrositler adı verilir. Daha az olgunlaşmış eritrositler makrositiktir ve hemoglobinlerinde mavimsi ton vardır (polikromatofili) veya RNA kalıntısı ve ribozomlara bağlı olarak hücrede ince bazofilik noktalar bulunur. Mikrositler çapları 6 mikrometreden küçük hücrelerdir. Normal eritroid hücreler yuvarlaktır(Şekil 35/A). Eritrosit  büyüklüğünde değişikliklere poikilositoz adı verilir.  Eritrosit   ortasında soluk bir bölge olmalı ve turuncu-kırmızı hemoglobin halkası bulunmalıdır. Hipokromi kötü hemoglobinlenmeyi yansıtır ve çok ince hemoglobin halkası veya merkezi soluklukta artış oluşturur. Anormal hemoglobin dağılımı merkezinde hemoglobin noktası ve etrafında soluk bölge olan bir hücre oluşumuna yol açar (hedef hücresi). Anormal hemoglobinler kristaller de oluşturur. Sferositler ve makrositlerde ortadaki soluk bölge yoktur çünkü hücrenin kalınlığı artmıştır. Eritrositler  inklüzyonlar da içerebilir; örneğin, çekirdek materyali kalıntıları (Howell-Jolly cisimcikleri), mitokondri veya siderozomların kalıntıları (Pappenheimer cisimcikleri) veya enfeksiyöz ajanlar (malarya parazitleri)(240).  Periferik yaymada patolojik eritrositlerle ilgili detaylar Tablo 27’de gösterilmektedir.

 

Tablo 27. Kan Yaymalarındaki Patolojik Eritrositler

 

Kırmızı Hücre Tipi

Tarif

Altta Yatan Değişiklik

Hastalık Durumu İlişkisi

 

Akantosit (mahmuz hücresi)

Düzensiz spiküllü eritrositler; ortası yoğun, değişken uzunlukta çıkıntılar vardır

Hücre membran lipidlerinde değişiklik

Abetalipoproteinemi, parenkimal karaciğer hastalığı, splenektomi sonrası

 

Bazofilik noktalar

Noktalı bazofilik inklüzyonlar

Presipite ribozomlar (RNA)

Kaba noktalar: kurşun zehirlenmesi, talasemi.

İnce noktalar: çeşitli anemiler.

 

Bite hücresi (degmasit)

Bir kenardan içeriye düz yarım daire

Dalak ile Heinz cisimciği çukurluğu

Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz eksikliği, ilaç ile indüklenen oksidan hemoliz.

 

Burr hücresi (ekinosit) veya dikenli eritrosit

Kısa, eşit aralıklı spikülleri olan, iyi korunmuş ortası soluk eritrositler

Hücre membran lipidlerinde değişiklik ile ilişkili olabilir

Genellikle artefakta bağlıdır. Üremi, kanamalı ülserler ve gastrik karsinomda görülür.

 

Kabot halkaları

Dairesel, mavi, ipliğe benzer, noktalı inklüzyon

Nükleer kalıntı

Splenektomi sonrası, hemolitik anemi, megaloblastik anemi.

 

Ovalosit (eliptosit)

Elips şekilli hücre

Anormal hücre iskelet proteinleri

 

Kalıtsal eliptositoz

Howell-Jolly cisimcikleri

Küçük, ayrı, bazofilik, yoğun inklüzyonlar; genellikle tekli.

 

Nükleer kalıntı (DNA)

Splenektomi sonrası, hemolitik anemi, megaloblastik anemi.

Hipokromik eritrosit

Belirgin merkezi solukluk

Azalmış hemoglobin sentezi

Demir eksikliği anemisi, talasemi, sideroblastik anemi.

Leptosit

Düz, ince, hipokromik hücre

-

Obstrüktif karaciğer hastalığı, talasemi

 

Makrosit

Normalden büyük eritrositler (>8.5µ); Hb ile dolu.

Genç eritrositler, anormal eritrosit olgunlaşması.

Artmış eritropoez. Megaloblastik anemide oval makrositler.

Karaciğer hastalığında yuvarlak makrositler.

 

 

Mikrosit

Normalden küçük eritrositler (<7.0 µ )

 

-

Hipokromik eritrosit

Pappenhaimer cisimcikleri

Küçük, yoğun, bazofilik granüller

Demir içeren siderozom veya mitokondri artıkları

 

Sideroblastik anemi, splenektomi sonrası.

Polikromatofili

Genellikle makrositlerde gözlenen grimsi veya mavi renk.

 

Ribozom materyali.

Retikülositoz,eritrositlerin kemik iliğinden erken salınması.

Rulo

Eritrosit  kümeleşmeleri; bozuk para kümesini andırır

Dolaşımdaki paraprotein nedeniyle eritrosit kümeleşmesi

 

 

Paraproteinemi

Şistosit (miğfer hücresi)

Şekli bozulmuş, fragmanlı hücre, iki veya üç sivri uçlu.

Mikrodolaşımın fibrin lifleri nedeniyle mekanik olarak bozulması; kalp kapak protezi nedeniyle bozulma.

Mikroanjiyopatik hemolitik anemi (dissemine damar içi pıhtılaşma, trombotik trombositopenik purpura), kalp kapak protezi, ciddi yanıklar.

 

Orak hücre (drepanosit)

İki kutuplu, spiküllü formlar, orak şeklinde, her iki ucu sivri

 

HbS’nin moleküler agregasyonu

Orak hücre hastalıkları, S özelliği dahil değil.

Sferosit

Merkezi soluk olmayan, yoğun görünümlü küre şekilli hücre, genellikle çapı azalmıştır

 

Azalmış membran tekrarları

Kalıtsal sferositoz, immünohemolitik anemi.

Stomatosit

Ağız veya çanak benzeri deformite

Membran defekti ve anormal katyon geçirgenliği

 

Kalıtsal stomatositoz, immünohemolitik anemi.

Hedef hücre (kodosit)

Nişan tahtası benzeri görünüm; genellikle hipokromik

Hücre membranı tekrarlarında azalma

Karaciğer hastalığı, splenektomi sonrası, talasemi, hemoglobin hastalığı.

 

Göz yaşı hücresi (dakriyosit)

Bozulmuş şekilli, gözyaşı damlasına benzer hücre

-

Miyelofibrozis, miyeloptizik anemi.

 

Kjeldsberg C, ed. Hematolojik hastalıkların pratik tanısı, 3.baskı. Chicago: ASCP Press, 2000’den alınmıştır.

 

 

 

 

 

 

Daha sonra trombosit sayıları ve morfolojisi incelenir. Trombositler kırmızı-mor granüllü küçük mavi sitoplazmik fragmanlar şeklinde görülür. Trombositlerin çapı 1-2 mikrometredir ve şekilleri çok değişkendir. Trombosit sayıları yaymadan belirlenebilir. Normal trombosit sayımında yağ imersiyon bölgesi başına birkaç (5-15) trombosit olmalı veya 10-20 eritrosit başına yaklaşık 1 trombosit olmalıdır. Trombositlerin antikoagüle edilmemiş kan veya parmak delmeyle alınan kan kullanıldığında agregasyon oluşturabilecekleri ve bunun trombosit sayılarının düşük olduğu gibi hatalı bir izlenime yol açabileceği akılda tutulmalıdır.

Lökosit morfolojisi ve dağılımı en son analiz edilir. Lökositlerin sayısı yaymanın  orta büyütme objektif incelenmesiyle saptanır. Daha büyük hücrelerin anormal dağılımı kan yaymalarının özellikle kenarlarının incelenmesiyle dışlanmalıdır. Periferik yaymasının kenarlarındaki lökositler  artefakt tarzında daha küçük (hücre küçülmesi ve hücrenin kötü yayılımı nedeniyle) veya daha büyük (hücrelerin parçalanması nedeniyle) görünebilir. Yayma hazırlanırken dikkatli olunmalıdır çünkü hücreler, özellikle neoplastik hücreler mekanik basınçla çok fazla parçalanabilir. Lökositlerin optimal morfolojisi kan yaymalarının derhal hazırlanmasını gerektirir. Uzun saatler bekletilen kanda anlamlı artefaktlar görülmeye başlar ve sitoplazmik vakuolleşme, nükleer karyoreksi ve sitoplazma parçalanmasını içerir(210).

Kan yaymasında normalde görülen lökositler; nötrofiller, eozinofiller, bazofiller, lenfositler ve monositleri içerir. Olgunlaşmamış miyeloid hücrelerin (miyelositler, metamiyelositler, promiyelositler ve blastlar) varlığı ayırıcı biçimde anormaldir. Manuel lökosit alt tip sayımı için en az 100 hücre belirlenmeli ve sayılmalıdır. Alt tip sayımı yaparak lökositlerin relatif popülasyonlarının tanımlanmasına ek olarak hücreler sitoplazma ve çekirdekteki morfolojik anormallikler yönünden yakından incelenmelidir. Örneğin, enfeksiyon veya büyüme faktörü tedavisi genellikle nötrofillerde primer (azurofilik) granüllerin görülmesinde artışa yol açar, buna toksik granülasyon adı verilir. Buna karşılık, pek çok miyelodisplastik bozukluk anormal çekirdek segmantasyonunun yanısıra nötrofillerde hipogranülarite ile karakterizedir. Bazı depo bozukluklarında veya lizozomal bozukluklarda sitoplazmik inklüzyonlar görülebilir(241).

 

3.5.12.1.1. Eritrositler

 

Sağlıklı bir kişinin kanında eritrositler, bir arada bulunmadıklarında çapları 6-8 mikrometre arasında değişen, dairesel, aşağı yukarı aynı büyüklükte homojen diskler şeklinde görülür (Şekil 50). Ancak normal kanda bile, ayrı hücreler 5.5 mm kadar küçük ve 9.5 mm kadar büyük olabilir. Her hücrenin ortası perifere göre biraz daha soluktur. Hastalık durumunda eritrositlerin hemoglobin miktarı, büyüklüğü, şekli ve boyanma özellikleri ile yapısı değişir. Bu değişiklikler aşağıda anlatılmıştır(41, 242).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

           

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

        Şekil 50.Periferik Yaymada Normal Olgun Eritrositlerin Görünüm

 

 

 
 

 

 

3.5.12.1.1.1. Hemoglobin İçeriği

 

Boyanmanın derinliği eritrositlerdeki hemoglobin miktarı hakkında kabaca fikir verir ve normokromik, hipokromik ve hiperkromik terimleri eritrositlerin bu özelliğini ifade etmek için kullanılır. Normokromik normal boyanma yoğunluğunu ifade eder (Şekil 37/A). Hemoglobin miktarı azaldığında ortadaki soluk bölge daha büyük ve daha soluk hale gelir. Buna hipokromi (şekil 37/B) adı verilir. MCH ve MCHC azalır . Megaloblastik anemide eritrositler daha büyük ve dolayısıyla da daha kalın olduğundan, pek çoğu derinlemesine boyanır ve ortadaki solukluk daha azdır (Şekil 37/C). Bu hücreler hiperkromiktir çünkü MCH’leri artmıştır ancak MCHC’leri normaldir. Kalıtsal sferositozda da hücreler hiperkromiktir. MCH normal olsa da, azalmış yüzey/volüm oranı nedeniyle MCHC genellikle artar. Aynı yaymada hipokromik hücrelerin ve normokromik hücrelerin varlığına anizokromi veya bazen dimorfik anemi adı verilir(Şekil 51). Bu durum sideroblastik anemilerin karakteristiğidir ancak demir eksikliği anemisinde demir tedavisinden haftalar sonra veya hipokromik anemide normal hücrelerin transfüzyonundan sonra da ortaya çıkabilir(41).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

A

 

           

               

                       

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

      

 

 

 

                                                                  

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 51. Demir Eksikliği Anemisinde Hipokromi, Anizositoz ve Poikilositoz (A:100x,B:1000x)

3.5.12.1.1.2. Polikromatofili

 

Eritrositlerde hafif mavi-gri renk (polikromatofili veya polikromazi) hemoglobinin asit boyalara afinitesi ile RNA’nın bazik boyalara afinitesinin bir kombinasyonudur. Eritrositte rezidüel RNA genç bir eritrositin kanda bir-iki gün kaldığını gösterir. Bu hücreler olgun eritrositlerden daha büyüktür ve ortalarında solukluk olmayabilir(Şekil 52). Rezidüel RNA bulunan genç hücreler Wright boyası ile boyanmış ve ortam havasında kurutulmuş yaymalarda polikromatofilik eritrositler ve parlak krezil mavisi ile supravital boyandıklarında görülen hücreler retikülositlerdir. Dolayısıyla, artmış polikromazi retikülositozu düşündürür; en çok hemolizde ve akut kan kaybında belirgindir.

 

 
 

 

 

 

A

        

                                        

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

          B

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

Şekil 52. A.Polikromazi. B.spesifik tedavi alan megaloblastik anemili hastanın periferinden leishman boyasıyla boyanmış bir  preparatda polikromazi

 

3.5.12.1.1.3. Büyüklük

 

Eritrositler anormal derecede küçük (mikrositler) ve anormal derecede büyük (makrositler)(Şekil 53/A) olabilirler veya büyüklük açısından anormal değişkenlik gösterebilirler (anizositoz). Anizositoz çoğu aneminin bir özelliğidir; derecesi yüksek olduğunda hem makrositler hem de mikrositler mevcuttur (Şekil 53/B). Anemi analiz edilirken mikrositik ve makrositik terimleri hücre çapından çok hücre hacmi dikkate alındığında en fazla anlama sahiptir. MCV doğrudan çok-kanallı bir analizörde ölçülür. Çap doğrudan kan yaymasından saptanır ve ondan volüm ve hemoglobin miktarı belirlenir. Ayrıca, sferositozlu hastaların kanındaki hücrelerin pek çoğunun çapı küçük olsa da normalden daha kalın oldukları için volümleri azalmadığı için MCV normal aralıktadır.

 

 

 
 

 

.

                

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                         B

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                               Şekil 53. A.Makrositer ve B.

 

 Mikrositer Hücreler

 

 

3.5.12.1.1.4. Şekil

 

Şekildeki farklılığa poikilositoz adı verilir.Anormal şekilli herhangi bir hücre poikilosittir.Oval, armut şekilli, gözyaşı damlası şekilli, eyer şekilli, miğfer şekilli ve düzensiz şekilli hücreler megaloblastik anemi gibi tek bir anemi durumunda görülebilir(Şekil 54).

 

 
 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 54.Poikilositoz. Eritrositler değişik şekillerde görülmektedir. Bu yayma genellikle gözyaşı   hücreleri ile karakterize minimal değişiklikler göstermektedir.

 

 

 

Eliptositler kalıtsal eliptositozda en yaygın şekilde bulunur (Şekil 55); burada hücrelerin çoğu elips şekillidir. Eliptositoz bazen hemolitik anemi ile ilişkili olan dominant bir hastalıktır. Eliptositler normal insan kanında bulunurlar ancak sayıları %10’dan azdır. Ancak demir eksikliği anemisi, miyelofibroz ile birlikte miyeloid metaplazi, megaloblastik anemiler  ve orak hücreli anemide daha yaygındırlar.

 

 

 
 

 

 

 

 

 

B

A

            B

                    

 

        

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 55. Eliptosioz.  A. Hücreler Oval Veya Sigara Şeklinde Görülür.  B.İkinci Şekil Psödo Eliptositoz.

 Genellikle Artefaktırlar.

 

 

  • Sferositler normal bikonkav disklerin aksine neredeyse küresel eritrositlerdir. Çapları normalden küçüktür(Şekil 56). Ortalarında soluk bölge yoktur veya merkezden uzakta, daha küçük bir soluk bölgeye sahiptirler. Çünkü hücre daha kalındır ve lam üzerinde tamamen düz durmak yerine hafif eğimli dururlar. Bu hücrelere kalıtsal sferositozda (HS), bazı otoimmün hemolitik anemi(AHA) olgularında  ve hücrelere yönelik doğrudan bir fiziksel veya kimyasal hasar(ısı gibi) olduğunda rastlanır. Bu üç durumdan herbirinde küçük membran parçaları(hemoglobin fazlası) erişkin eritorsitlerden uzaklaştırılır ve geriye yüzey/volüm oranı azalmış hücreler kalır. HS ve AHA’da bu hücreler retiküloendotelyal sistemde ortaya çıkar; diğer durumlarda (vücut yanıkları olan hastalar gibi) ise intravasküler bölgede olabilir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

             

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 56. A.düşük ve B. Yüksek güçte sferositlerin görüntüsü.( eritrositler normalden sferik formdadır. Bu hücreler daha koyu boyanır ve daha küçük çaplı oluşlarıyla tanınırlar)

 

  • Hedef hücreler normalden daha ince olan eritrositlerdir ve boyandıklarında ortada koyu renkte hemoglobin içeren bir bölgenin bulunduğu periferik bir hemoglobin halkası gösterirler(Şekil 57). Bunlar hücre yüzey membranında artış olan obstrüktif sarılıkta, hücre yaşlandıkça yüzey membranında normal azalmanın olmadığı postsplenektomi durumunda, hipokromik herhangi bir anemide (özellikle talasemi) ve hemoglobin C hastalığında saptanır.

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

              B

 

 

       

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                       

 

 

Şekil 57. A.Βeta–Thalassemi Minörlü bir hastanın periferinde target hücrelerine eşlik eden hipokromi ve anizositoz poikilositoz  b. İkinci şekil aynı hastanın target hücrelerinin dominant olduğu başka bir alandaki görüntüsü.

 

Şistositler(hücre fragmanları) megaloblastik anemide, ciddi yanıklarda veya mikroanjiyopatik anemide  hemoliz varlığını gösterir(Şekil 58). Sonraki durum küçük kan damarlarında fibrin veya küçük kan damarı hastalığı ile ilişkilidir ve intravasküler fragmantasyona yol açar; miğfer şekilli hücreler ve üçgen şekilli hücreler özel karakteristiktir. Burr hücreleri düzensiz kontrakte eritrositlerdir ve belirgin spiküllere sahiptir ve aynı süreçte gözlenir; ancak bu eritrositler farklı hematologlar tarafından farklı şekillerde kullanılmakta ve kafa karışıklığına yol açmaktadır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                    

            

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

           Şekil 58. Burr Hücreleri. Üremi ve mikroangiopati gibi durumlarda fragmente şistositlerle beraber  bulunur.

 

 

                 

  • Akantositler düzensiz spiküllü kırmızı hücrelerdir ve spiküllerin uçları şişkin ve yuvarlaktır; bunlar kalıtsal veya edinsel abetalipoproteinemide ve belirli karaciğer hastalığı olgularında görülür. Tırtıklı hücreler veya ekinositler düzenli kontrakte hücrelerdir ve yaygın olarak yaymaların hazırlanması sırasında artefakt şeklinde görülebilirler veya hiperozmolarite veya diskosit-ekinosit dönüşümüne bağlı olarak ortaya çıkabilirler(Şekil 59). İn vivo koşullarda çeşitli nedenlerle eritrositteki adenozin trifosfat (ATP) düzeyindeki azalmayla ilişkili olabileceği yönündedir. Eritrositlerin  içine girinti yapan küçük boşluklar veya kabarcıkları içeren ve tırtıklı hücreleri andıran artefaktlar. Bu wright boyası ve fiksatif olarak kullanılan metanol ve kontamine eden  çok az miktardaki sudan kaynaklanabilir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

              

         

                   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                         

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 59.  Akantositler: hücre emmbranının düzensiz dalgalanmasını gösterir Bu görünüm genellikle eritrositlerin hipertonik tuzlu veya hücrelerin sıvı kaybından kaynaklanır.

 

 

 

 

3.5.12.1.1.5. Bazofilik Noktalanma (Noktalı Bazofili)

 

Eritrosit içerisinde düzensiz bazofilik granüllerin varlığıyla karakterize bir durumdur.  Granüller küçük veya kaba olabilir(Şekil 60). Wright boyasıyla koyu mavi boyanırlar. Bunları içeren eritrositler diğer açılardan normal şekilde boyanabilirler veya polisitokromatofili sergileyebilirler. Küçük noktalanma artmış polisitokromatofilinin ve dolayısıyla eritrositlerin üretiminde artışın görüldüğü durumlarda ortaya çıkar. Kaba noktalanma kurşun zehirlenmesi veya hemoglobin sentezinin bozulduğu diğer hastalıklarda, megaloblastik anemide ve diğer şiddetli anemi formlarında görülebilir; genç hücrede anormal RNA instabilitesi ile ilişkilendirilir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 60. Bazofilik Noktalanma.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

İçerisinde inorganik demir içeren granüller (bulunan eritrositlere siderositler adı verilir. Bunlar demire özgü boyalarla gösterilir. Bazen bu granüller Wright boyasıyla boyanır; boyandıklarında bunlara Pappenheimer cisimcikleri adı verilir. Bazofilik noktalanmanın aksine, Pappenheimer cisimcikleri belirli bir eritrositte az sayıda bulunur ve splenektomi haricinde periferik kanda nadiren görülür(Şekil 61).

 

          

 

       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  Şekil 61. Pappenheimer Cisimcikleri

 

 

 

3.5.12.11.6. Howell-Jolly Cisimcikleri

 

Bu partiküller nükleer kromatinin düzgün, yuvarlak kalıntılarıdır. Tekli Howell-Jolly cisimcikleri megaloblastik anemide, hemolitik anemide ve splenektomiden sonra görülebilir. Tek bir hücrede çok sayıda Howell-Jolly cisimciği (Şekil 62) megaloblastik anemi veya başka bir anormal eritropoez formunu düşündürür.

 

 

 

 

 

 

 

   

      

           

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  Şekil 62. Pernisiyoz anemide Howel-jolly cisimcikleri içeren makrositik eritrositler

 

 3.5.12.1.1.7. Kabot Halkaları

 

Bunlar halka şeklinde, 8 rakamı şeklinde veya çember şeklindeki yapılardır. Bazen iki veya daha fazla konsantrik çizgiyle oluşurlar(Şekil 63). Bunlar pernisyöz anemide, kurşun zehirlenmesinde ve belirli başka eritropoez hastalıklarında eritrositlerde nadiren görülürler. Wright boyasıyla kırmızı veya kırmızımsı mor şeklinde boyanırlar ve içlerinde yapılar yoktur. Bu halkalar muhtemelen mitoz mekiğinden kalan mikrotübüllerdir. Anormal eritropez kanıtı olarak yorumlanırlar.

 

 

                                  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

      Şekil  63. Kabot Halkaları

 

 

 

 

 

3.5.12.1.1.8. Malaryal Noktalanma

 

Plasmodium vivax içeren eritrositlerde küçük granüller görülebilir. Wright boyasıyla küçük granüller (“Schüffner granülleri”) morumsu kırmızı renkte boyanır( Şekil 64/A). Bunlar bazen sayıca o kadar fazladır ki, parazitleri maskelerler. Bu eritrositler kural olarak normalden büyüktür.

 

 

 

       
 
 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 64. A. P.Vivax Enfeksiyonlarında Rozet Yüzük Şeklindeki Hücreler Ve B.Şizont Gelişimi

 

3.5.12.1.1.9. Rouleaux (Rulo) Oluşumu

 

Bu durum eritrositlerin birbirinin üzerine yığılmaları sonucunda madeni para şeklinde görülmeleridir (Şekil 65). Ortam havasında kurutulan yaymalarada rulolar görülür. Plazma fibrinojen ve globulin düzeyinin yükseldiği durumlarda rulolar oluşur ve aynı zamanda bu parametreler eritrosit sedimantasyon hızını arttırırlar. Rulo oluşumu paraproteinemide (monoklonal gammopati) özellikle belirgindir. Eritrositlerde aglütinasyon veya kümeleşme ıslak preparatlarda rulolardan daha emin şekilde ayırt edilir ve ortam havasında kurutulan yaymalarda doğrusal rulolar yerine daha düzensiz ve yuvarlak kümeler görülür. Bu görünümden soğuk aglutininler sorumludur.

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Şekil 65. Belirgin ve Orta Düzeyde Rulo Formasyonu

 

 

 

3.5.12.1.1.10. Çekirdekli Kırmızı Hücreler (nRBC’ler)

 

Çekirdekli kırmızı hücreler(normoblastlar, nRBC’ler) kanda çekirdeksiz olgun eritrostilerin prekürsörleridir. İnsanda nRBC’ler  sadece kemik iliğinde bulunur (Şekil 66 ). Oluşum basamakları (erken dönemden geç döneme) pronormoblast, bazofilik normoblast, polisitokromatofilik normoblast ve ortokromatik normoblasttır.

Genellikle, hastalık durumunda kanda ortaya çıkabilen çekirdekli kırmızı hücreler polikromatik normoblastlardır. Ancak bazılarında sitoplazma o kadar bazofiliktir ki, çekirdeğin karakteri, yoğun boyanan kromatin ve kromatinin parakromatinden keskin şekilde ayrılması dışında hücreyi eritroid olarak tanımak zordur. Bu tip eritroid hücreler hatalı olarak lenfositler şeklinde algılanır; bu hata çekirdeğin dikkatli incelenmesiyle genellikle giderilir. Megaloblast sadece daha büyük bir normoblast değil, ayrı, çekirdekli bir eritroid hücredir. Büyük boyutları ve anormal “açık” nükleer kromatin paterni ile karakterizedir. Bu dizideki hücreler normal ilikte bulunmaz ancak pernisiyöz anemi veya başka megaloblastik anemileri olan hastaların iliğinde ve bazen de kanında karakteristik olarak mevcuttur( Şekil 66/C).

Kanda nRBC’lerin ve nötrofilik serinin olgunlaşmamış hücrelerinin varlığı lökoeritroblastotik reaksiyon olarak adlandırılır. Miyeloid metaplazili miyelofibroz, metastatik karsinom, lösemiler, multipl miyelom, Gaucher hastalığı gibi genellikle ilikte yer kaplayan bozuklukları gösterir(248). Metastatik malignite olan hastalarda lökoeritroblastotik reaksiyon ilikte tümör tutulumunun iyi bir göstergesidir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

         

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                     C

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 Şekil 66. A-B. Periferik Kanda Late Megaloblastlar.C. Megaloblastik Anemide nRBC’ler

 

 

 

 

 

 

 

3.5.13. Manuel Lökosit Alt Tip Sayımında Hata Kaynakları

 

Çok iyi hazırlanmış periferik yaymalarda bile, lökosit alt hücre sayımı rastgele dağılım hatalarına açıktır. Aynı hastada günden güne veya lamdan lama farkların yorumlanmasında, farklılığın ne kadarının sadece tesadüfe bağlı olduğunun belirlenmesi yararlıdır(249). Tablo 28’de toplam 100-1000 lökosit sınıflanarak yapılan alt tip sayımlarında hücrelerin farklı yüzdeleri için %95 güven limitlerini göstermektedir. İki ayrı sayımdaki yüzdeler karşılaştırılırken, bir rakam diğerinin güven limitlerinin dışında kalırsa, farkın anlamlı olması muhtemeldir (tesadüfe bağlı değil). Dolayısıyla, 100 hücre içeren bir alt tip sayımında monositler birinci günde %5 ve ertesi gün %10 ise, farkların sadece örnekleme hatasına bağlı olması muhtemeldir. Fark gerçek olsa bile, az sayıda hücre sayıldığından bundan emin olunmaz. Öte yandan, alt tip sayımında toplam 500 hücre varsa, %5-%10 arasındaki fark anlamlıdır; farkın gerçek olduğu ve tesadüfe bağlı olmadığından emin olunabilir (hata olasılığı %5). Elbette, bu alt tip sayımlarında ortaya çıkan hataların minimal tahminidir çünkü mekanik hataları (kan örneklerinin alınması, yetersiz karışım, yaymanın tip ve kalitesine bağlı olarak dağılım düzensizlikleri ve iyi boyanmamadan kaynaklanan farklılıklar) veya hücrenin tanımlanmasındaki hataları (gözlemcinin yargısına ve deneyimine dayanır) içermez. Titizlikle uygulanan teknik ve doğru ve tutarlı hücre sınıflaması gerekir. Sonuçları yorumlayan kişiler olası hata kaynaklarının özellikle de hücrelerin dağılımında tesadüfe bağlı hataların farkında olmalıdır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tablo 28. Lökosit  Alt Tip Sayımlarında Tayin Edilen Hücrelerin Farklı Yüzdeleri İçin %95 Güven Limitleri

A

N=100

    N=200

N=500

N=1000

N=10000

 

0

 

0.0-3,6

 

0,0-1,8

 

0,0-0,7

 

0,0-0,4

 

0,0-0,1

1

0,0-5,4

0,1-3,6

0,3-2,3

0,5-1,8

0,8-1,3

2

0,0-7,0

0,6-5,0

1,0-3,6

1,2-3,1

1,7-2,3

3

0,6-8,5

1,1-6,4

1,7-4,9

2,0-4,3

2,6-3,4

4

1,1-9,9

1,7-7,7

2,5-6,1

2,9-5,4

3,6-4,5

5

1,6-11,3

2,4-9,0

3,3-7,3

3,7-6,5

4,5-5,5

6

2,2-12,6

3,1-10,2

4,1-8,5

4,6-7,7

5,5-6,5

7

2,9-13,9

3,9-11,5

4,9-9,6

5,5-8,8

6,5-7,6

8

3,5-15,2

4,6-12,7

5,8-10,7

6,4-9,9

7,4-8,6

9

4,2-16,4

5,4-13,9

6,6-11,9

7,3-10,9

8,4-9,6

10

4,9-17,6

6,2-15,0

7,5-13,0

8,2-12,0

9,4-10,7

15

8,6-23,5

10,4-20,7

12,0-18,4

12,8-17,4

14,3-15,8

20

12,7-29,2

14,7-26,2

16,6-23,8

17,6-22,6

19,2-20,8

25

16,9-34,7

19,2-31,6

21,3-29,0

22,3-27,8

24,1-25,9

30

21,2-40,0

23,7-36,9

26,0-34,2

27,2-32,9

29,1-31,0

35

25,7-45,2

28,4-42,0

30,8-39,4

32,0-38,0

34,0-36,0

40

30,3-50,3

33,2-47,1

35,7-44,4

36,9-43,1

39,0-41,0

45

35,0-55,3

38,0-52,2

40,6-49,5

41,9-48,1

44,0-46,0

50

39,8-60,2

42,9-57,1

45,5-54,5

46,9-53,1

49,0-51,0

55

44,7-65,0

47,8-62,0

50,5-59,4

51,9-58,1

54,0-56,0

60

49,7-69,7

52,9-66,8

55,6-64,3

56,9-63,1

59,0-61,0

65

54,8-74,3

58,0-71,6

60,6-69,2

62,0-68,0

64,0-66,0

70

60,0-78,8

63,1-76,3

65,8-74,0

67,1-72,8

69,0-70,9

75

65,3-83,1

68,4-80,8

71,0-78,7

72,2-77,7

74,1-75,9

80

70,8-87,3

73,8-85,3

76,2-83,4

77,4-82,4

79,2-80,8

85

76,5-91,4

79,3-89,6

81,6-88,0

82,6-87,2

84,2-85,7

90

82,4-95,1

85,0-93,8

87,0-92,5

88,0-91,8

89,3-90,6

91

83,6-95,8

86,1-94,6

88,1-93,4

89,1-92,7

90,4-91,6

92

84,8-96,5

87,3-95,4

89,3-94,2

90,1-93,6

91,4-92,6

93

86,1-97,1

88,5-96,1

90,4-95,1

91,2-94,5

92,4-93,5

94

87,4-97,8

89,8-96,9

91,5-95,9

92,3-95,4

93,5-94,5

95

88,7-98,4

91,0-97,6

92,7-96,7

93,5-96,3

94,5-95,5

96

90,1-98,9

92,3-98,3

93,9-97,5

94,6-97,1

95,5-96,4

97

91,5-99,4

93,6-98,9

95,1-98,3

95,7-98,0

96,6-97,4

98

93,0-99,9

95,0-99,4

96,4-99,0

96,9-98,8

97,7-98,3

99

94,6-99,9

96,4-99,9

97,7-99,7

98,2-99,5

98,7-99,2

100

96,4-100,0

98,2-100,0

99,3-100,0

99,6-100,0

99,9-100,0

 

N=sayılan hücre sayısı; a:belirli hücrelerin gözlenen yüzde değerleri.Limitler 100,200, 500, ve 1000 verilmiştir.n=10.000 Freeman tayin ettiği değerlerdir. Courtney of Prof. C. L. Rümke’nin verilerinden alınmıştır.

 

 

Manuel hücre alt tip sayımları çeşitli hücre tayin hatalarına açıktır; bunların bazıları gözlemcinin eğitim düzeyine ve deneyimine, bazıları ise motivasyon, yorgunluk, stres veya dikkat kaybı düzeyine bağlıdır. Teknisyenlerin karşılıklı eğitimine ilişkin güncel uygulamalarda mikroskopik analizin yetersiz uygulanması nedeniyle problemler oluşabilir. Bunda renk körlüğü de rol oynayabilir ancak bu bir kişinin morfolog olarak kabul edilmemesine yol açmamalıdır. Gözlemcinin emin olmadığı hücreleri sayımda “atlaması” şeklindeki yaygın uygulama kesinlikle önlenmelidir çünkü anlamlı morbiditenin gözden kaçırılmasına neden olabilir.

Belirli hücre tiplerinin gözlemciler arasında daha büyük uyumsuzluğa yol açtığı da bilinmelidir: gözlemciler eozinofil sayımlarında nadiren uyumsuzluk gösterirler ancak monosit veya bant nötrofil sayımlarında sıklıkla uyumsuzdurlar. Bu uyumsuzluğun  nedeni, eozinofiller için morfolojik kriterlerin kolaylıkla tanımlanması ancak küçük bir monositin büyük, granüllü bir lenfositten (NK hücresi) ayırt edilmesinin zor olmasıdır. Genellikle en düşük tekrarlanabilirlik ve doğruluk sonuçları aynı dizi içerisinde farklı olgunlaşma düzeylerine sahip hücrelerin sayımında gözlenir. Örnekler bant ve segmentli nötrofillerdir ve daha az sıklıkla, olgunlaşmamış (promiyelositler, miyelositler ve metamiyelositler). granülositlerdir: Çok sayıda gözlemci ile morfolojik kriterlerin tutarlı olarak uygulanmasının çok zor olduğu ve farklı kurumlar veya ülkelerde bunun daha da zorlaştığı bilinmektedir. Dolayısıyla, hücre tiplerinin morfolojiye göre  subjektif ayrımı sıklıkla tutarsız sonuçlara yol açar: elektronik hücre analizi, monoklonal antikora dayalı akış sitometrisi veya görüntü analiz algoritmaları lökosit popülasyonlarına uygulandığında tutarsızlık olasılığı azalır.

 

3.5.14. Periferik Yaymalarda Morfolojik Değerlendirmedeki Farklılıklar  

 

            Eritrositlerin morfolojisinin tanımlanmasında kantitatif terminolojinin kullanımında ve değişik ülkeler arasında standardizasyon yoktur. Birçok ülke periferik yayma çalışmalarında kaliteyi geliştirmek için çalışmalar yapmaktadır(253). Burada esas amaç incelemeyi yapan teknisyen ve laboratuvardan kaynaklanan bağımsız değişkenlerin standardize edilmesidir. Genellikle kullanılan kriterler ve terminolojide anlamlı farklılıklarla karşılaşılmaktadır. Bu farklar 6 başlık altında incelenebilir.

1.     İlk olarak; laboratuvar aynı durum için  “önemsiz” ,“nadir” ,”aralıklı” , “birkaç adet” , “ılımlı” , “ orta” , ve “ + ” gibi terimler kullanılmaktadır.

2.     İkinci olarak “band” ve segmente nötrofil arasındaki fark sorunuda aşikardır. “hipersegmentasyon”ve “stab” teknisyenleri olduğu gibi aynı zamanda “yüksek band” ve “düşük band” diye yorumlayan  labarotuarlar da bulunmaktadır.

3.     Üçüncü olarak;  mikro veya makrositoz bulunduğunu saptamada kullanılan kesin kriterler bulunmamaktadır. “Normal” bir dağılım bulunması halinde bile, bunlar sıklıkla anormallik veya anizositoz şeklinde bildirilmektedir.

4.     Dördüncü olarak; atipik lenfositleri tanımlarken “hiperbazofilik lenfosit” “monosite-benzer lenfosit”, “lenfosit-benzer monosit”, “plazmasellüler lenfosit”, “virosit”, pfeiffersel” ve “lenfomonosit”, “mononükleozis infeksiosa hücresi” gibi isimlendirmeler kullanılır.

5.     Beşinci olarak; hücreler ve anomallikleri tanımlamada kullanılan dilde farklılık vardır.

6.     Son olarak, preparatların mikroskopik incelemelerinde kullanılan prosedür de tektip (üniform ) değildir.

 

 Eritrositler hem kalitatif hem kantitatif ana noktaları ile formüle edilmelidir. Kalitatif ana hatları formüle ederken, büyüklük, renk, biçim ve muhtemel inklüzyonlar olduğu kadar, normal eritrositler de tanımlanmalıdır. İsimlendirme, anormalliklerin tanımlanması ve bu anormalliklerin göstereceği hastalıklar da tanımlanmalıdır. Çeşitli boyama metodlarının test edilerek karşılaştırılma yapılarak boya metodu seçilmelidir. Mikroskopik değerlendirme prosedürleri de önerilmektedir. Kantitatif ana ilkeler formülasyonu, mikroskop tipi, magnifikasyonu, ve yayma tekniklerindeki farklılıklardan dolayı birim alana düşen hücre sayısını kullanarak yapılan kantifikasyon gibi uygulamalardır. Genel olarak geçerli bir yöntem olan 1000 eritrosite düşen hücreyi saymak yoğun emek isteyen ve rutin uygulamalarda kullanılmayan bir metodtur. Teknisyenlerin birim alana düşen hücreleri sayıp bu sonuçları her 1000 eritrosit için formüle ederek sonuç vermelidirler. Bu sistemde hafif, ılımlı gibi terimler kullanmak yerine “+”, “++” ve “+++” ifadelerin kullanması tercih edilmelidir. Hücre anormallikleri, büyüklükleri, formu, rengi ve inküzyonları tanımlamak için kantitatif kriterler formüle edilmelidir.

Sonuç olarak kemik iliği ve periferik kan hücrelerinin yorumlanmasında  standartizasyon gerekmektedir. Bundan dolayı tüm laboratuar sorumluları ve hematoloji uzmanları için eğitim programları uygulanmalıdır. Yeni prosedürle ilgili testleri uygulayan laboratuvar diğer hastane doktorları ve genel pratisyenlere detaylı bilgi vermelidir. Sonuçlar ülkenin tümünde bir bütünlük oluşturmalıdır. Tıbbi laboratuvarda standardizasyon eksikliği laboratuvalar için önemli bir problemdir. Yorumlama hataları, laboratuvar ve hekimler arasında yanlış iletişimi arttırmakta ve hekimlerin kararlarında yanlışlıklara neden olabilmektedir.

 

3.5.15. Hücre Alt Tipi Sayımı Uygulamaları

 

Lökosit alt tip sayımının temeli Paul Ehrlich ve diğer araştırmacıların bundan yüzyılı aşkın süre önce anilin boyaları kan hücre preparatlarına uygulamaları ve kan hücrelerini mikroskopla tayin için görülür hale getirdikleri günlere uzanmaktadır(248). Bazı lökosit alt tip sayım uygulamaları bugün demode gibi görünse de ve klinisyenlerin bunların sayılarına duydukları güven herzaman kanıtlanamasa da, testin klinik bilgi ve karar alma için güçlü destekleyici veriler sağladığı inkar edilemez.

Hematopoetik ağaç primitif kök hücreden tam farklılaşmış, fonksiyonel son hücrelere kadar incelendiğinde, farklılaşma yolları ayırt edilebilir ve ağacın dallarının fonksiyonel son hücrelerine farklı sayımlar uygulanabilir. Farklılaşma ve olgunlaşma terimleri kabaca eşdeğer kabul edilecektir ve her ikisi de olgun olmayan bir hücreden olgun, fonksiyonel son hücre aşamasına doğru hücresel değişimin (hücre bölünmesi + hücre değişikliği veya sadece hücre değişikliği) devam eden fizyolojik sürecini tanımlamak için kullanılır. Fonksiyonel son hücrelerin ayrı sayımları farklı hücre dizilerini birbirinden ayırır ve bir kan veya kemik iliği örneğinde bu dizilerin dağılımındaki değişiklikleri gösterebilir. Belirlenmiş bir referans aralığıyla karşılaştırıldığında bu gösterge klinik açıdan yararlı bilgiler sağlayabilir. Artmış lenfosit sayısı (özellikle atipik veya varyant morfolojili) enfeksiyöz mononükleozis gibi belirli viral enfeksiyonlar ile ilişkili olabilir. Diğer viral enfeksiyonlar (örn., insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile ilişkili olanlar) dolaşımdaki lenfosit sayısında azalmaya yol açabilir.

Hücre alt tip sayımının kan hücrelerinin farklı tiplerde fonksiyonel son hücrelere (diziler) ayrılmasından ibaret olmadığının anlaşılması önemlidir; tek bir dizi içerisinde farklı olgunlaşma düzeylerindeki hücrelerin dağılımı hakkında bir fikir verebilir. Ancak alt tip sayımı sadece morfolojik tayin ile yapıldığında anlamlı sınırlamalar mevcuttur. Diziler birbirlerinden kolaylıkla ayırt edilebilse de yatay hücre sayımı; Şekil 67/B), basamaklı morfolojik kriterleri (segmentli nötrofillere karşılık bant veya stab hücreleri) tek bir hücre dizisi içerisinde biyolojik farklılaşma seyrine uygulamak kolay değildir dikey hücre sayımı; Şekil 67/D). Bu nedenle, sola kaymayı morfolojik yollarla tayin etmek zordur. Sola kaymanın doğru tanımlanması özellikle yenidoğanlarda ve yaşlı popülasyonda bakteriyel enfeksiyonun tanımlanmasında yararlı olabilir ancak sola kaymayı oluşturanın morfolojik özellikleri hakkında görüş birliği yoktur. Dikey alt tip sayımının diğer bir formu promiyelositler, miyelositler ve metamiyelositler gibi daha da az olgunlaşmış nötrofillerin tayininde görülür. Bu,  spesifik hücre tipleri arasında zorluklara yol açabilir ancak grup olarak olgunlaşmamış granülositler bunlar olgun nötrofiller ve bant formlarından ayırt edilebilmek için morfolojik açıdan yeterince farklıdırlar.

Yeni nesil hematoloji kan hücre analizörleri ile kemik iliği analizi de yapılmaktadır. Bir uygulama miyeloid: eritroid oranını (M: E) daha etkin biçimde belirlemektir. Diğerleri blast hücre sayımlarını ve miyeloid farklılaşma paternlerini içerir. Yeni teknolojik gelişmeler eritroid serilerde de olgunlaşma davranışlarını inceleme olanağını sağlamıştır. Klinik laboratuara geliştirilmiş differential sayımın(EDC) girişiyle birlikte, kemik iliği ve vücut sıvısı örneklerinin elektronik analizinin hızla artacağı ve manuel mikroskopinin yerini büyük ölçüde alacağı öngörülmektedir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 67. Hematopoetik ağaç. A. Hamatopoezde stem cell modelin şematik gösterilişi. B. Her nesilin ayrılması ve büyümesi prosesi C. Yatay hücre sayımında fonksiyonel son hücreler D.Dikey Hücre Sayımında belirli nesil hücreleri

 

Vertikal alt tip sayımı hematopoetik kemik iliğindeki olgunlaşma ve farklılaşma süreçlerinin değerlendirilmesinde yardımcı bir araçtır ( Şekil 53 ). Vertikal alt tip sayımının rollerinden biri olgunlaşmamış retikülosit fraksiyonu (IRF) ile benzerdir. IRF olgunlaşmamış retikülositlerin çoğunun sayısını kendileri de olgunlaşmamış kırmızı kan hücreleri olan tüm retikülositlerin oranı şeklinde gösterir. Retikülosit sayılarının eritrosit yapım hızını (eritropoez) yansıttığı iyi bilinse de, IRF’nin kesin rolü birçoklarına göre henüz tam olarak tanımlanmamıştır. IRF ile retikülosit sayıları arasındaki kinetik ilişkiye bakıldığında IRF’nin retikülosit sayısından farklı olduğu anlaşılır. Bu durum kanser tedavisinin bir parçası olarak otolog kemik iliği tekrarlı infüzyonu alan hastada gösterilmiştir. Hasta stabilize edici sitotoksik rejimi aldıktan sonra, IRF değerleri retikülosit sayıları normalin altına düşmeden önce normalin altına iner. Buna karşılık, graftlanma gerçekleştikçe retikülosit sayıları yanıt vermeden önce retikülosit sayıları normale yükselir. Bu tip değişiklikler ve parametreler arasındaki ilişkiler yapım sürecinin genel olarak kabul edilen yorumlarına uygulandığında, retikülosit sayısının eritropoezin ilk göstergesini (RBC yapım hızı) temsil ettiği anlaşılır. Dolayısıyla IRF değişiklikleri eritrositlerin yapım hızındaki değişiklik hızını yansıtır (yapım hızının ikinci göstergesi). Olgunlaşmamışlık düzeyinin yüksekliği eritrositler yapım hızlarında artışı, daha az olgunlaşmamışlık ise azalmayı gösterir. Benzer şekilde, sola kaymış nötrofiller nötrofil yapım hızında artışı gösterir; bu durum tipik olarak enfeksiyondan veya G-CSF veya GM-CSF gibi hematopoetik büyüme faktörlerinin uygulanmasından kaynaklanır.

Uygun şekilde ifade edildiğinde (yani herhangi bir spesifik hücre dizisinde olgunlaşmamış hücrelerin oranı) vertikal alt tip oranı o dizinin yapım sürecinin ikinci göstergesine işaret edebilir(yapım hızındaki değişiklik oranı). ++

İkinci gösterge ölçümleri önemlidir çünkü değişiklikler gerçek kemik iliği veriminde (spesifik hücre sayıları) değişiklikler olmadan önce gözlenirler ve IRF’de güçlü predictiv değerlerine sahiptirler. Bu tip ölçümlerin miyeloid ve diğer diziler için kullanıma geçecek olması heyecan vericidir ancak bunlar henüz tam uygulanmamaktadır.

Miyeloid ve eritroid dizi için vertikal alt tip sayımı hematoloji analizörlerinde giderek rutin hale gelecektir ve zorluk bu tip parametrelerin laboratuara uyarlanması ve bunların klinisyenler için erişilebilir ve yararlı hale getirilmesinde yaşanacaktır.

Elektronik hücre tayini ve sayımı rutin laboratuar morfoloji sayımına eşdeğer veya onu aşan bir gelişmişlik düzeyine ulaşmıştır. Elektronik olarak yapılan lökosit alt tip sayımı manuel yöntemlerden çok daha fazla kesinliğe sahiptir ve doğrulukları çoğunlukla eşit veya daha iyidir. Hem maliyet hem de işlem süreleri elektronik sayımlar için daha azdır. Genişletilmiş alt tip sayımı laboratuarlara kemik iliği ve vücut sıvısı örnekleri gibi karmaşık örneklerde sayım yapma imkanı verir. Manuel gözden geçirme ihtiyacı giderek daha fazla azalacaktır ve yeni parametreler ortaya çıkabilir. Bunlar kemik iliği aspirasyonu veya biyopsi yapılmaksızın hematopoez kinetiklerini ölçme yöntemleri gibi gelişmeleri  içerebilir.

Elektronik alt tip sayımları ile elde edilenle karşılaştırıldığında, kan hücre popülasyonları ve onların öncülerinin rutin morfolojik analizi ile oldukça az bilgi elde edilir. Manuel, optik (morfolojik) lökosit alt tip sayımı 20.yüzyılın büyük kısmında lökosit alt popülasyonları analizinin temeltaşı olmuşsa da, Romanowsky ile boyanmış yaymaların morfolojik analizinden kaynaklanan sınırlamaların klinik kullanım potansiyelini etkilediği bilinmektedir.

 

3.5.16. Morfolojik Analizin Yerini Alan Teknolojiler

 

Kan ve kemik iliği gibi  diğer dokuların morfolojik analizi halen önemli bir role sahipse de, pek çok rutin amaçlar doğrultusunda onun yerini giderek başka teknolojiler almaktadır. Gelişmiş ülkelerin çoğunda lökosit ve eritrosit morfolojisinin periferik yayma ile değerlendirilmesi yerini büyük ölçüde, kan hücrelerinin sitokimyasal veya enzim sitokimyasal prosesiyle birlikte elektronik analiz formlarına bırakmıştır. Monoklonal antikor dayalı akış sitometrisindeki son gelişmeler  kan, kemik iliği ve lenf düğümü analizinin diğer alanlarına anlamlı katkılarda bulunmuştur(249). Morfolojik analizin yerini akış sitometrisinin alma derecesi tek bir ülkede kurumdan kuruma değişebilmektedir ancak son 15 yılda önemli düzeye ulaşmıştır. Bu eğilim geniş bir yelpazede monoklonal antikorların geliştirilmesi ve küme tanımlarının (CD’ler, cluster designations) hücresel fizyolojisi ve antikorların yöneltildikleri epitoplar hakkında daha fazla bilgi edinilmesiyle desteklenmiştir. Sadece monoklonal antikorlarla tanı koyma potansiyeli muazzam biçimde artmamıştır, aynı zamanda akışa dayalı sonuçların tarafsızlığından dolayı gözlemcinin kendi öznelliğinden etkilenen morfolojik yorumlamaya göre daha fazla tercih edilmektedir. Son olarak, büyük sayılardaki hücrelerin oldukça daha kolay analiz edilebilmesi akış sitometrisiyle elde edilen verilerin manuel mikroskopiye göre çok daha fazla kesinlik içermesini de sağlamıştır(250).

Tüm bu faktörlere ek olarak çok ileri düzeydeki cihazlar ve bilgisayar analizleriyle akış sitometrisini klinik kullanım için müthiş bir araç haline getirmiştir. Ayrıca akış sitometrisi hücre fizyolojisi hücre metabolizması, apoptozis ve ilaç yanıtı hakkında klasik morfolojik analiz ile elde edilemeyen bilgiler de verebilmektedir. Klasik morfoloji uygulamalarının bazı kısımlarının yerini alan diğer bir metodoloji dokuların ve hatta her bir hücrenin moleküler analizidir. Örnekler minimal rezidüel hastalığın saptanması, çoklu ilaç direncinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile saptanması ve ayrı hücrelerdeki kromozom anormalliklerinin floresan in situ hibridizasyon (FISH) teknikleri ile belirlenmesini içerir(251-252).

Klasik manuel mikroskopiye dayalı analizlerin rolü azaldıkça, hematoloji analizörleri ile elektronik hücre analizi, monoklonal antikorların kullanıldığı akış sitometrisi ve moleküler diagnostikler kan, kemik iliği veya vücut sıvılarındaki kan hücrelerini içeren tanısal yaklaşımlar da giderek daha güçlü roller oynayacaktır.

 

3.5.17. Otomatik Yömtemlerle Lökosit Alt Tip (Differantial) Analizi

 

Referans Lökosit Alt Tip Sayımı (Orantılı) ve Cihaz Yöntemlerinin Değerlendirilmesi

 

Otomatik lökosit alt sayım sistemleri klinik laboratuarı yoğun emek isteyen ve zaman alan bir çalışmadan kurtarmaktadır. Laboratuar personelinin becerisinin, değişen eğitimin ve görsel algılamanın yerini otomasyon alacağından sonuçların doğruluğu artacaktır. Ayrıca otomasyonla insan gözüyle inceleme ile sınıflanabilenden çok daha fazla hücrenin sayımıyla sonuçların kesinliği daha da artacaktır. Otomasyon için farklı düzeylerde birçok otomatik cihaz geliştirilmiştir. Bu farklı otomatik cihazların hedeflenen kullanımları ve örnekleri şunlardır:

 (1) Normalde dolaşımda bulunan hücreleri tablo halinde gösteren ve normalden diğer sapmalar veya herhangi anormal lökositler için işaret veren otomatik hücre saptayıcıları ve sınıflayıcıları

(2) Normal ve anormal lökositleri sınıflayan cihazlar; tarama için uygundur

(3) Tanı için uygun olan normal ve anormal lökosit sınıflayıcıları (işaretleme sistemleri)

(4) Yukarıda belirtilen kullanımlardan birine ek olarak insan kanında bulunan olgunlaşmış hücrelerin (lökositler, eritrositler ve/veya trombositler) paternlerini (büyüklük, şekil ve/veya boyanma) kalitatif ve/veya kantitatif olarak belirleyen cihazları içermektedir..

  Normalde insan kanında dolaşan hücrelere ek olarak bu hücrelerin tanımlanmasını herzaman gerektirmeyen hücreler diğer hücre kategorisi ile sınırlıdır. Dolayısıyla, klinik yönden anormal örneklerin görsel incelenmesi için işaretlemek performans değerlendirmesinin zorunlu bir parçasıdır. Lökositlerin kabul edilebilir referans aralıkları hakkındaki görüşler çeşitlidir ve bu tanımı karmaşıklaştırmaktadır. Mutlak sayılara karşılık orantılı (yüzde) sayıların arzu edilirliği konusunda anlaşmazlık vardır. Bu konuları adil biçimde ele almak için, bu standarttaki yöntemler kullanıcı tarafından belirlenen referans aralığı kriterleri ile birlikte kullanılmalıdır(210).

 

3.5.17.1. Dijital Görüntü İşlemcileri(Patern Tanıma Sistemleri)

(Periferik Yayma Lamlarını Kullanarak Patern Tanıma Esasıyla Hücre Tayini Yapanlar )

 

 Patern tanıma sistemleri ilk kez 1970’lerin başında piyasaya girmiştir ve Hematrack, Coulter diff 3 ve diff 4, Abbott\R ADC 500 ve Lökosit Otomatik Tanıma Sayım Cihazı gibi cihazları içerir. Bu teknoloji boyanan ve cihaza yerleştirilen periferik yayma lamlarını  kullanarak ölçüm yapar(255-256). Bilgisayar lökosit çekirdeğine karşılık gelen koyu boyanmış bir alan saptayana kadar mikroskobu mekanik olarak hareket ettirir. Bilgisayar her hücrenin hücre büyüklüğü, çekirdek ve sitoplazma rengi ve dansitesi hakkındaki verileri kullanarak veri paternlerini her bir lökosit tipi özellikleriyle eşleştirir ve hücreleri tanımlar. Patern tanıma teknolojisinin çoğu manuel sayımlar ile aynı  dezavantaja sahiptir. Bu dezavantajlar; sayılan hücre sayısının sınırlı olması, anormal hücre tiplerini sınıflamasındaki zorluklar ve hücre dağılım özellikleridir(257). Otomatik patern tanıma sistemleri teknisyenin harcadığı süreyi kısaltsa da  akışlı yöntemlere göre anlamlı olarak daha yavaştırlar. Dolayısıyla şu anda patern tanıma sistemleri nadiren kullanılmaktadır ve bu cihazlar artık üretilmemektedir.

Homojen hazırlanmış ve boyanmış periferik yayma motorla çalışan mikroskop basamağına koyulur. Bilgisayar lamı tarayarak kontrol eder ve sahada lökositler olduğunda taramayı durdurur. Optik detaylar örneğin, çekirdek ve sitoplazma büyüklüğü, yoğunluğu, şekli ve rengi  televizyon kamerasıyla kaydedilir,  bilgisayar tarafından analiz edilir ve dijital forma dönüştürülür; bu özellikler farklı hücre tiplerinin bu tip özelliklerini içeren hafızadaki bilgi bankasıyla karşılaştırılır. Patern normal hücre tipininki ile uyumluysa, hücre bu şekilde tanımlanır; aksi takdirde diğer veya bilinmiyor şeklinde tanımlanır. Bilinmeyen hücrelerin koordinatları cihaz tarafından saklanır ve teknisyenin sınıflama yapabilmesi için sayım sonunda tekrar gösterilir. Böyle sistem üreticileri kan boya bileşimi, stabilite ve tekrarlanabilirlik konularında anlamlı ilerlemeler kaydetmişlerdir(258).

Bu tip dört sistem piyasada mevcuttur ve klinik açıdan incelenmiştir: LARC (Lökosit Otomatik Tanıma Bilgisayarı) (Corning Medical Instruments, Medfield, MA), Hematrak (Geometric Data Corp, Wayne, PA), “diff-3 sistemi” (Coulter Electronics, Hialeah, FL) ve ADC-500 (Abbott Laboratories, Dallas, TX). Bu dijital görüntü işlemcilerinin sonuncusu (Hematrak) 1986’da piyasaya sunuldu. Bazı sistemleri hala kullanıldığından ve prensip önemli olduğundan, konu kısaca ele alınmaktadır.

Hematrak  Romanowsky boyasıyla boyanmış filmleri kullanır ve yaklaşık 40 saniyede 100 lökositi sınıflar. Eritrosit morfolojisi ve trombosit hesaplamaları sayımdan önce veya sonra yapılır(259). Otomatik retikülositler, otomatik trombosit sayıları ve otomatik eritrosit programları için programlar bulunmaktadır. Lökosit, anormal hücreler ve band nötrofilleri tanımlama özelliğinin tatmin edici olduğu bildirilmiştir(260). Sonraki Hematrak modelleri (480, 450, 450 QP ve 590 gibi) eritrosit morfolojisi ve trombosit sayıları ve lökosit alt tip sayımlarını yapabilmesi için lam kasetlerine sahiptir. Hematrak 590, 100 kan yaymasını yaklaşık 1,5 saatte test edebilir. Bu cihazlarda diğer patern tanıma cihazlarının aksine, lam veya santrifüjlenmiş yaymalar kullanılabilir.

1994’de Intelligent Medical Imaging (IMI), Inc. (Palm Beach Gardens, FL) otomatik, tek başına çalışan Micro 21 adlı mikroskobu piyasaya sundu. Şu ana kadar sadece lökosit alt tipi sayımı yapan cihazlar Gıda ve İlaç Kurumu’nun (FDA) onayını aldı. Başka mikroskoplu prosedürler de (retikülosit sayımı, vücut sıvıları, AFB’ler, DNA probları) planlanmaktadır. “Neural Vision” IMI’ patentli nöral ağ ve görüntü işlemcisidir. Ölçülen veya saptanan hücre özellikleri patern tanıma metodolojisiyle analog gibi görünmektedir.

 

3.5.17.2. Çok-Kanallı Cihazlar (Akışlı Sistemler)

 

Akışlı sistemler lökosit alt tip sayımı gerçekleştirmek için çok sayıda lökosit sayarak  hücreleri, hücre büyüklüğü, karmaşıklığı veya boyanma özelliklerine göre tanımlayarak analiz eder. Çok kanallı cihaz  yöntemleri aşağıda belirtilmiştir.

 

3.5.17.2.1. Lökosit Tayinini Hem Hücrenin Büyüklüğüne Hem De Sitokimyasal Boyama Tekniklerine Göre Yapan Sistemler

 

Hücrelerin miyeloperoksidaz boyama özelliklerini kullanan sistemler; kan örneklerini, eritrositleri parçalayarak ve lökositleri fikse ederek hücreleri sürekli akış sitometrik  yoluyla sayar. Bu sistemler Technicon H6000, H*1, H*2, H*3 serisidir(261). Hücreler bir dilüentle süspanse edilir ve parlak alan dedektöründeki  bir akış odacığından geçirilerek miyeloperoksidaz boyanın sitokimyasal özelliklerine ve analiz edilen her bir hücrenin hücre büyüklüğüne göre  analiz edilirler(63).

  1. Veriler hücre büyüklüğü (ışık saçınımı) y ekseninde ve miyeloperoksidaz boyama yoğunluğu veya aktivitesi x ekseninde olacak şekilde bir saçınım grafiğinde işaretlenir. Grafik nötrofiller, lenfositler, monositler, eozinofiller, bazofiller ve boyanmamış büyük hücreler gibi lökosit alt tiplerini gösterir.
  2. Toplam lökosit sayısı ve nötrofil, lenfosit, monosit ve eozinofillerin sayısı miyeloperoksidaz kanalında sayılır.
  3. Lenfositler küçük (düşük saçınımlı) hücreler şeklinde tanımlanır.
  4. Daha büyük atipik lenfositler, blastlar veya dolaşımdaki plazma hücreleri büyük, boyanmamış hücre kanalına düşer.
  5. Nötrofiller güçlü peroksidaz boyanma gösterir ve daha büyük hücreler şeklinde görülür.
  6. Eozinofiller çok güçlü peroksidaz boyanma gösterirler ancak ışık saçınımlarının bir kısmını abzorbe ettiklerinden nötrofillere göre daha küçük görünürler.
  7. Monositlerin peroksidaz aktivitesi daha düşük düzeydedir ve genellikle nötrofiller ile büyük, boyanmamış hücre alanları arasında saptanır.
  8. Sistem nötrofil alanını sınırlamak için değişken miyeloperoksidaz eşik değerleri kullanır ve bu eşik değerler miyeloperoksidaz boyanması bakımından örnekler arasındaki farklar için düzeltme yapılmasını sağlar.

 

Otomatik akışlı sistemler ile bazofilleri sayan modeller (Technicon H*1, H*2, H*3 serisi)  bazofil nükleer lobularite kanalını kullanır. Bu tayin için eritrositler  ve lökositler ayrı ayrı lizise uğratılır ve geriye lizise dayanıklı olan ve daha sonra hücre büyüklüğüne göre sayılan bazofiller dışında çıplak lökosit çekirdekleri kalır. Lökosit çekirdeklerinden elde edilen ışık saçınım verileri, olgun lenfosit çekirdeklerine göre daha düşük ışık saçınımı gösteren blastların belirlenmesine de yardımcı olur. Nükleer lobularite (çekirdek lobları) indeksi mononükleer ve polinükleer hücrelerin sayısına ait bir ölçüttür ve ortalama peroksidaz aktivitesi ve hücre sayısı verileriyle ilişki kurularak, olgunlaşmamış nötrofillerin veya çekirdekli eritrositlerin saptanmasına yardımcı olabilir. Bu anormal hücre popülasyonları cihaz tarafından işaretlenir ve periferik yaymanın morfolojik gözden geçirmesini gerektirir. Bu sistemlerin kullanıldığı çalışmalar akut lösemiler, miyelodisplastik sendromlar  ve akut enfeksiyon veya enflamasyonu tanımlama becerisinin iyi olduğunu göstermiştir(262-265). Bu tekniği kullanan analizler her örnek için binlerce hücreyi inceler ve bu istatistiksel doğruluğu arttırır. Bu yöntemi kullanan cihazlar aşağıda belirtilmiştir.

 

 3.5.17.2.1. Bayer-Technicon Kan Sayım Sistemleri

 

3.5.17.2.1.1. H*1/H*2/H*3

 

H*1 cihazı tezgah üstü oldukça küçük tek örnekli bir analizördür. Bu cihaz saatte 80 CBC ve trombosit sayımı yapar. Technicon H*2 cihazı saatte 100 CBC ve lökosit alt tip tayini yapar ve H*1 e göre daha hızlıdır. H*3 saatte 100 örnek ile otomatik retikülosit analizi yapar. Technicon sistemleri  48 saat önce alınmış eski kan örneklerinde bile doğru sonuçlar verdiğini iddia etmektedir.

H*1 peroksidaz analizi için bir tungsten halojen ışık kaynağına ve sitometreye sahiptir. Bu sitokimyasal reaksiyon için gereken süre 75 °C’ye ısıtma yapılarak azaltılır. Analizörün bilgisayarı katı saçınım ve abzorpsiyon eşik değerleri yerine, ayrı hücre tiplerinin toplu analizini gerçekleştirir. Her örnek için nötrofil boyama yoğunluğunun bir ölçütü olan ortalama peroksidaz indeksini(MPXI; referans aralığı -1 ila +10) de belirlenir. Bu indeks konjenital veya edinsel miyeloperoksidaz eksikliği olan hastaların saptanmasını sağlar(266). Lökositler ayrı bir kanalda(bazofil/lobularite) helyum-neon kırmızı lazer ışık kaynağı ile birlikte küçük ve büyük açılı saçınımlı dedektörler kullanılarak analiz edilir. Bazofil/lobularite kanalında, sürfaktan ve ftalik asit içeren bir seyreltici eritrositleri parçalar ve bazofiller haricindeki tüm hücrelerin sitoplazmasını uzaklaştırır(267). Y ekseninde küçük açılı öne saçınım dedektöründen alınan sinyal gösterilir. Sitoplazmalarını koruduklarından ve dolayısıyla yatay eşiği geçtiklerinden bazofiller sayılır. X ekseninde daha büyük açılı dedektör sinyali işaretlenir. Bu sinyal geri kalan çekirdeklerin şekil ve yapısından(dansite) etkilenir. Mononükleer hücreler sola düşer ve yapılandırılmış veya lobullü çekirdekleri olan hücreler ise sağa düşer; bunlar dikey bir eşik ile ayrılır. Blastlar genellikle en sağa kayarlar; x ekseninde sağa doğru gidildikçe lenfositler ve monositler varsa olgunlaşmamış granülositler mononükleer bölgede yer alır, bandlar, eozinofiller, nötrofiller ve çekirdekli eritrositler ile karşılaşılır. Peroksidaz ve bazofil/lobularite kanallarının sonuçlarının karşılaştırılması ve birleştirilmesi blastlar, atipik lenfositler, olgunlaşmamış granülositler, sola kayma ve NRBC’ler için spesifik işaretlerin verilmesini sağlar(73, 268).  

H2 cihazında bazofil/lobularite kanalında total lökosit sayısı da belirlenir ve peroksidaz kanalı WBC sayımının doğrulanması olarak kullanılır. H-6000 peroksidaz kanalında  total ve lökosit alt tipi sayımları ile  bazen anormal hemoglobinlerin saptanmasını sağlar(örn., Hb C, S, E, D). RBC/trombosit verileri bazofil/lobularite kanalının lazere dayalı optik sisteminin kullanılmasıyla elde edilir. Eritrositler kürelere (volümde değişme olmaz) dönüştürülür ve glutaraldehit ile hafifçe fikse edilir. RBC’ler küresel hale geldiğinde küçük açılı saçınım RBC büyüklüğünün bir fonksiyonudur; buradan MCV, RDW ve anizositoz, mikrositoz ve makrositoz işaretleri belirlenebilir. Yüksek açılı saçınım esas olarak RBC dansitesiyle (hücre başına düşen hemoglobin konsantrasyonu) belirlenir. Bu, kromazi (anizokromi), hipokromi ve hiperkromideki farklılıkları (VAR) işaretler ile gösterilmesine izin verir. Hücre volümüne karşı frekans histogramları ve hemoglobin konsantrasyonuna karşı frekans histogramları oluşturulabilir. Bu histogramlar küçük oranlarda bulunan anormal eritroid popülasyonlarının saptanmasını sağlar. H*1’in klinikte kullanımı ile ilgili bilgiler aşağıda belirtilmiştir(269-272).

  • Hemoglobin konsantrasyon verilerinden hemoglobin dağılım genişliği(HDW) de hesaplanır. Artmış HDW değerleri orak hücreli anemide yararlı bir parametredir.
  • H*1 eritrogram paterni talasemi taramasında faydalı bir parametredir.
  • H*1’deki yüksek nötrofil miyeloperoksidaz aktivitesi (MPXI) megaloblastik anemide yararalı bir göstergedir.(Özellikle MCV değerleri 100 fl’nin altında olduğunda)
  • H*1 ile hemoglobin konsantrasyon histogramı ile herediter splenocytosis’da hiperkromik mikrositik eritrositlerin yüksek oranını göstermede çok iyi olduğu ve splenektomi yapılmamış hastalarda ise bu oranda çok daha belirgin bir artış olduğu gösterilebilir.

 

3.5.17.2.2. Elektriksel İmpedans ve Işık Saçınım Özelliklerine     Göre Ölçüm Yapan Sistemler

 

Elektriksel impedans ve ışık saçınım özelliklerine  göre ölçüm yapan sistemler; lökosit alt tiplerinin sayımında kullanımlarının yanısıra, büyük hücre popülasyonlarını analiz edebilmeleri nedeniyle her hücre tipinin sayısını tekrarlanabilir ve doğru şekilde verebilirler.Bu sistemlerin prensibi hücre karmaşıklığına ve hücre volümüne dayanır(63, 273-274).

Bu tip cihazlarda lökosit alt tip(differantial) sayımı ve lökosit volüm tayinininde kullanılan elektriksel impedans yöntemiyle veya bu yöntemle ışık saçınım ölçümlerini birleştiren yöntemle yapılır. Başlangıçta bu yöntemle sadece nötrofiller, monositler ve lenfositler sayılabiliyordu. Bunun örneği Coulter S-Plus analizör serisidir(273-276). Bu yöntem lökosit lizisinden sonra çekirdek etrafındaki hücre sitoplazması ve sitoplazmik granüllerin yıkılmasını esas alır. Hücreler üç ayrı büyüklükte popülasyona ayrılır; büyük hücreler (nötrofiller), ara hücreler (monositler) ve küçük hücreler (lenfositler). Bu tip cihazlar büyüklüğü kesin olarak belirlenemeyen popülasyonlar olduğunda periferik yayma yapılması gerektiğini belirten bir işaret vermektedir. Bu tip teknoloji en iyi nötrofillerin ve lenfositlerin sayımında yararlıdır. Ayrıca, eozinofiller, bazofiller, atipik lenfositler, blastlar, olgunlaşmamış granülositler ve plazma hücreleri gibi diğer hücre popülasyonları monositik bölgeye veya granülosit bölgesine girme eğilimi gösterirler. Bundan dolayı bu verilerin yorumlanması zorlaşmaktadır. İncelenen  normal veya anormal hasta popülasyonuna bağlı olarak yalancı negatifliklerin oranı (gerçek anormal popülasyonun analizör tarafından saptanmadığı örnekler) % 4-16 arasındadır. Bu cihazlar genellikle tarama testi olarak kullanılırlar.

Bu elektriksel impedans ve ışık saçınım özelliklerine     göre ölçüm yapan sistemler  ve donanımlar daha yüksek hızla sayım yaparlar. Bu hematoloji analizörlerinin en yaygın kullanılanları aşağıda anlatılmıştır.

 

3.5.17.2.2.1. Coulter  Kan Sayım Sistemleri

 

3.5.17.2.2.1.1. Coulter Prensibi

 

İçerisinden akım geçirilen bir açıklıktan geçen hücreler elektriksel dirençte değişikliklere neden olur ve voltaj pulsları olarak sayılırlar(17, 171, 277). Bu prensip Coulter (MAXM, STKS, GEN.S vs.; Beckman Coulter, Inc. Brea., Ca), TOA (Sysmex , NE-8000, SE-9000 vs.; TOA Medical Electronics, Los Alamitos, CA), Abbott (Cell-Dyn 3500, 3700, 4000 vs.; Abbott Diagnostics, Abbott Park, IL), ABX (Micros 60, Pentra 60, Pentra 120, Pentra 120 Retic vs.; ABX Diagnostics, Inc. Irvine, CA) ve diğer firmaların ürettikleri cihazlarda kullanılmaktadır. Hücre şeklini koruyan izotonik iletken bir solüsyon (Isoton gibi) içerisinde kanın doğru şekilde seyreltilen bir süspansiyonu hazırlanır. Cihaz iletken sıvı ile doldurulabilen cam bir silindire (GC) sahiptir ve içerisinde bir elektrod (E2) ve duvarında 100 mm çapında bir açıklık (apertür) (A) bulunur. Cam silindirin hemen dışında başka bir elektrod (E3) bulunur. Silindir kısmen cıva (M) ile dolu olan ve iki elektriksel temas noktası (EC1 ve EC2) bulunan U şeklinde cam bir tübe bağlıdır. Cam silindir sayılacak olan hücre süspansiyonu içerisine daldırılır, iletken solüsyon ile doldurulur ve bir valf (V) ile kapatılır. Böylece E1 ve E2 arasındaki açıklıktan akım geçer. Cıva tüpte yukarıya doğru gittikçe, hücre süspansiyonu silindirdeki açıklığa doğru çekilir. Açıklıktan geçen her hücre eşit hacimde iletken sıvının yerini alır ve böylece direnci iletken solüsyonun direncinden çok daha fazla olduğundan elektriksel direnci arttırarak bir voltaj pulsu oluşturur. Hücrelerin hacmiyle yükseklikle doğru orantılı olan pulslar sayılır. Buna Coulter prensibi adı verilir(Şekil 68).

En basit sistemde sayma mekanizması cıva EC1 ile temas ettiğinde başlar ve EC2 ile temas ettiğinde durur. Bu süre içerisinde EC1 ve EC2 temas telleri arasındaki cam borunun hacmine eşit süspansiyon hacmindeki hücreler sayılır. Aynı anda iki veya daha fazla hücre açıklıktan girerse tek puls olarak sayılırlar; bu durum eşzamanlılık hatasına yol açar. Şu anda analizörler bu tip hataları otomatik olarak düzeltebilmektedir. Eşik ayarı veya puls ayırt edicisi belirli sayaçlarda ayarlanabilir yüksekliğin altındaki pulsların dışlanmasını sağlar. Diğerlerinde ikinci bir eşik belirli bir yüksekliğin üzerindekipulsların sayımını dışlar. Dolayısıyla iki durum arasında sadece penceredeki hücreler sayılır. Her bir eşiğin belirli artışlar ile sistematik olarak değiştirilmesiyle relatif hücre hacimlerinin frekans dağılımı belirlenebilir. Bu tip hücre büyüklük dağılımları otomatik olarak grafiğe işlenebilir ve iki veya daha fazla değişen hücre popülasyonu bulunduğunda eritrositler, lökositler veya trombositlerin analizinde değer taşır. Bu, kan hücre histogramlarının tayininde temel oluşturur ve şu anda çok-kanallı hematoloji analizörlerinde rutin olarak kullanılmaktadır.

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 68. Coulter Prensibi

 

 

 

 

1960’ların başlarında geliştirilen elektriksel impedans prensibini ilk kez Coulter analizörleri kullanmıştır(278). Çoğu cihazda tam kan doğrudan aspire edilir ve hücrelerin büyüklüğünü koruyan ve elektrik iletken isoton içerisinde mekanik yolla seyreltilir. Eritrosit ve trombosit ölçümlerini yapmak için bir dilüsyon kullanılır. Başka bir dilüsyonda eritrositler parçalanır ve hemoglobin hemoglobinsiyanide dönüştürülür. Bu süspansiyondan hemoglobin konsantrasyonu yaklaşık 530 nm’de kolorimetrik yolla ölçülür ve lökosit parametreleri belirlenir. Eritrosit ve lökosit hücre sayıları elektrikal rezistans ve puls voltaj prensibine dayanarak üçer kez belirlenir. Bir sonuç diğer ikisinden önceden belirlenen miktardan daha fazla farklı olmadıkça üç apertür tayininin ortalaması alınır; bu durumda uyumsuz sonuç dışlanır ve diğer ikisinin ortalaması yazdırılır. Üç sonucun hepsi uyumsuz ise, hiçbiri kabul edilmez (“vote out”= red) ve hiçbir değer yazdırılmaz. MCV ve eritrosit dağılım genişliği (RDW) RBC histogramından belirlenir. Hematokrit MCV’nin eritrosit sayısı ile çarpılmasıyla elde edilir. Diğer göstergeler (MCH, MCHC) hesaplanır. Kan Hücre Histogramları; RBC’ler ve trombositler için histogramlarda x aksisine  hücre büyüklüğü(fl), y aksisine ise hücrelerin mutlak sayısı işaretlenerek histogramlar türetilir(Şekil 69). Ortalama hücre ve yayılma büyüklüğünün tayininde ve alt popülasyonların saptanmasında kullanılır. Dağılımlar katod ışın tübünde sayısal veriler ile birlikte gösterilebilir ve yazdırılabilir(41).  Histogramların inclenmesi kalite kontrol aracı olarak  incelenebilir. Tablo 29-30’ da trombosit ve eritrosit histogramlarının özellikleri belirtilmiştir.  Histogramlar incelendiğindesiyah çizgi normal hücre dağılımını göstermektedir. Kırmızı çizgi eritrositler ve trombosit histogramı üzerinde ise çok mikrositik eritrositlerin  etkisini göstermektedir. Birçok histogramlarda kırmızı çizgi, siyah çizginin üstünde gösterilir.

 

 
 

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

          

 

 

 

 

 

 

 

 

 

           
   

 

 
 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

      

 

 

 

 

       
   
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 69. Histogramlar. A.Normal PLT ve RBC histogramı B.Küçük eritrositler ve dev trombositlerin   histogram üzerinde gösterilişi.

 

 

Tablo 29. Trombosit Histogramının Özellikleri (Kalite Kontrol Aracı Olarak Kullanılması)

                             

Göstergeler

 

Muhtemel nedeni

 Yorum

Histogramın sola doğru pik yapması(2-8 fl)

 

Sitoplazmik fragmentler

Periferik yayma yapılır

Histogramın sağa doğru pik yapması

Şiştosit, mikrosit ve dev trombositler

Periferik yayma yapılır.

CBC kontrolü yapılır.

(MCV↓&RDV↑,MPV↑& PDV↑)

 

Bimodal pik

Sitoplazmik fragmentler

Periferik yayma yapılır.

 

VerilerHematology in the Physician Office Laboratory Section I, Kathleen Kelly B.S., MT(ASCP), Iowa Üniversitesi, alınmıştır.

Tablo 30. RBC Histogramının Özellikleri (Kalite Kontrol Aracı Olarak Kullanılması)

 

Göstergeler

Olası nedenler

Yorum

 

Eğrinin sol kenarının alt çizgiye değmesi

Şistosistler ve çok kücük eritrositler

Periferik yayma yapılır

CBC ve PLT histogramını kontrol et

 

Bimodal pik

Transfüze edilen  hücreler

Tedaviye cevap

 

Perferik yayma yapılır

Eğrinin sağ bölümünün uzaması

 

Eritrosit otoaglütinasyonu

Periferik yayma ve CBC yapılır.

Eğrinin sağa kayması

mikrositler

Periferik yayma ve CBC yapılır.

 

Eğrinin sola  kayması

Makrositler

Periferik yayma ve CBC yapılır

 

VerilerHematology in the Physician Office Laboratory Section I, Kathleen Kelly B.S., MT(ASCP), Iowa Üniversitesi, alınmıştır.

 

 

 

3.5.17.2.2.1.1.1. Coulter STKS ve Gen-S

 

Coulter STKS ve Gen-S volümü ölçmek için elektriksel impedansı, iletkenliği ölçmek için yüksek frekanslı elektromanyetik alanları ve hücre sitoplazmasının karmaşıklığını veya granül içeriğini belirlemek için monokromatik lazeri kullanır. Bu cihazlar saatte 144 örnek analiz edebilir. Bu cihazlar lökositleri nötrofiller, lenfositler, monositler, eozinofiller ve bazofillere ayırabilen üç boyutlu saçınım grafiği oluştururlar ve anormal popülasyonları işaretlerler(279-284).

COULTER STKS Akış sitometrisine dayalı bu model eşzamanlı volümetrik impedans ölçümlerini (V), yüksek frekanslı elektromanyetik hücre problamasından elde edilen hücre iletkenliği (C) ve lazer ışık kaynağından (S) elde edilen saçınım ile birleştiren VCS teknolojisini kullanır. WBC’ler elektrooptik akış hücresinde orijinale yakın durumlarında analiz edilir. Tipik olarak 8000’in üzerinde WBC analiz edilir veya 20 saniye sayılır (hangisi önceyse). Hücre volümü klasik Coulter impedans prensibi ile belirlenir. İletkenlik hücrelerin iç bileşenleri (kimyasal bileşim, nükleus özellikleri ve granül içeriği) hakkında bilgi veren yüksek frekanslı elektromanyetik bir prob kullanılarak belirlenir. İletkenlik küçük lenfositler ve bazofiller gibi büyüklükleri yakın hücrelerin ayırt edilmesinde özellikle önemlidir. Helyum-neon lazer ile oluşturulan monokromatik ışığın öne açılı saçınımı hücre yüzey özelliklerini, morfolojisini ve granülleri belirler. Lazer ışık saçınımı (DF1) eozinofiller gibi granüllü hücrelerin tanınmasında özellikle önemlidir. Her hücrenin grafikte VCS ölçümlerine göre işaretlenmesiyle her hücre üç boyutlu grid üzerinde karakteristik lökosit kümesine yerleştirilir. Saçınım değerleri farklı popülasyon dansiteleri için renkli kodlar ile CRT’de gösterilir.

Gen.S cihazı retikülositleri otomatik olarak sayar. Hassasiyeti ve işaretlemeyi arttırmak ve lökosit alt tip sayımını gözden geçirme oranını azaltmak için geliştirilmiş algoritmalara ve yazılımlara sahiptir. Örnek hazırlama reaksiyon kinetikleri, reaktif reaksiyon sıcaklığı, maruz kalma süresi ve ortam koşullarına bağlı dağılım volümlerinde ayarlamalar yapılarak daha iyi kontrol edilir. Adaptif gate teknolojisi ile hücre tiplerinin üs üste örtüşen  hücre kümelerinin daha iyi ayrılması sağlanır. NRBC, nötrofil (NE) blastı, lenfosit (LE) blastı, monosit(MO) blastı ve varyant lenfositler için kuşku işaretleri verilir. Gen.S  cihazına opsiyonel olarak otomatik lam hazırlayıcısı(slide maker) entegre edilebilir.

 

13.5.17.2.2.1.1.1.2. Coulter LH 750

 

LH 750 kan sayım cihazı, klinik laboratuarlarda az zamanda çok iş yapılmasını sağlayan, kullanımı kolay, güvenilir ve saatte 110 örneği analiz eden bir sistemdir(285). Her bir örnekte CBC ve NRBC sayımı, retikülosit sayımı ve 5 tip lökosit alt tipi sayımı, anormal flag ve lökosit sayımlarında  interfere edici maddeleri elimine ederek doğrulanmış lökosit sayımı yapan tam otomatik bir hematoloji analizörüdür. Tam otomatik random acces fonksiyonu sayesinde aynı anda pek çok parametrenin analizini gerçekleştirebilir. Bu özelliği sayesinde aynı anda  sadece CBC, CBC ile beraber Differential, retikülosit veya 3 mod beraber (CBC+CBC Diff + CBC Diff Retic + CBC Retik + Retik) çalışabilir. Ayrıca kemik iliği ve vücüt sıvılarında(CSF, pleural, peritonal, perikardiyal veya sinovial sıvıları) RBC, diff ve nRBC sayımını doğru şekilde analiz eder.

Bu analizör volüm,iletkenlik ve saçınım teknolojisi ile lökosit ve lökosit alt tiplerini, trombosit ve anormal hücrelerin tanımlayan flag işaretlerini ve NRBC sayımını bu teknikle sayar. Coulter VCS teknolojisinin 3 boyutlu özelliği ile her hücre hacim, ışık saçılım ve iletkenlik özelliklerine göre ayrı ayrı ve ayrıntılı olarak analiz edilmektedir. Hidrodinamik odaklama ile kuartz flow cell içinde hızla ve tek tek hücre analizi gerçekleştirilmektedir. Gerçek üç boyutlu hacim ölçümü sırasında, hücreler elektriksel dirençlerindeki değişimlere göre sayılmaktdır. Bu radyofrekans enerji kaynağı kullanılarak her hücre için iletkenlik analizi yapılmaktadır. 1 ile 70 arasında değişen çok açılı ışık saçınım özelliklerine göre hücreler büyüklük, granülarite, yüzey biçimi, ve yansıma özelliklerine göre değerlendirilmektedir. Tüm bu hücreler, 8000’in üzeri hücrede ve her hücre için aynı anda analiz edilmektedir. Böylece hücre karakteristikleri ile anormalliklerin kesin ve hassas tayinleri gerçekleşmektedir. LH 750 cihazında WBC, RBC VE Plt sayımlarında AccuCount teknolojisi kullanılmaktadır. Sitopenik örneklerde(WBC, RBC,Plt ) analiz süresi otomatik uzatilamaktadır ve MCV’yi direkt ölçmektedir.WBC linearitesi 400.000 trombosit için ise 3.000.000 kadar lineerdir. LH 750 analizörü süper teknolojik donatıma sahiptir. nRBC sayımı ve random access özelliği ile yüksek kapasiteli laboratuaralar için örneklerin analiz öncesi işlemlerini eliöminde eder vekliniğe sonuçlar çok hızlı ulaşır.bu sistemin test accurasısı oldukça yüksek ve hala gelişmeye devam etmektedir. Accu-Count teknolojisi endüstri teknolojisinde devrim yaratan bir tekniktir. Coulter prensibini doğruluk, kesinlik ve linearite gibi geniş kapsamlı ilerlemiş algoritmalarla güçlendirerek birleştitirir. Bu teknoloji yalancı pozitif işaretleri azaltarak, örnek tekrarlama, örnek dilüsyon işlemleri ve periferik yayma yapma, manuel lökosit düzeltme gibi operatör gerektiren işlemleri elimine ederek test yöntemlerinin verimliliğini arttrırır. Bu cihaz yüksek kapasiteli laboratuarlar için uygundur.

 

3.5.17.2.2.2. Sysmex  Kan Sayım Sistemleri

 

3.5.17.2.2.2.1. Sysmex NE-8000

 

Sysmex NE-8000 saatte yaklaşık 120 örnek analiz edebilir. Bu cihaz WBC’leri granülosit, lenfosit ve monosit kategorilerine yerleştirmek için doğru akım elektriksel impedansına ve radyo frekans iletkenliğine sahip hidrodinamik olarak odaklanan bir akış sitometresi kullanır. Sysmex NE-8000 monositleri, nötrofilleri ve lenfositleri belirlemek için elektriksel impedansı ve elektromanyetik verileri kullanır ve daha sonra  bir lizis ajanı ile eozinofilleri ve bazofilleri tanımlar. Eozinofiller ve bazofiller diğer hücre tiplerinin lizisinden veya küçültülmelerinden sonra impedans büyüklük ölçümü kullanılarak iki ayrı kanalda selektif biçimde sayılır. Nötrofiller ayrı ölçülen eozinofiller + bazofillerin toplamı toplam granülosit sayısından çıkartılarak hesaplanır(286-287).

NE-8000 beş tip lökosit popülasyonun kabul edilebilir ayrı sayımlarını da verir ve diagnostik kullanım açısından güvenli ve etkin olduğu kabul edilir .

 

3.5.17.2.2.2.2. Sysmex SE-9000

 

Sysmex SE-9000’nin prensibi Sysmex NE-8000 ile aynıdır sadece blast ve olgunlaşmamış miyeloid hücreler hakkında ek bilgiler veren olgunlaşmamış hücre kanalı eklenmiştir. Bu kanal WBC işaretlerinin spesifiklik ve doğruluğunu arttırır ve işaretleme derecesinin kantitatif olarak gözden geçirilmesini sağlar(288).

 

3.5.17.2.2.2.3. Sysmex XT

 

Sysmex XT-2000 i  cihazı  saatte 80 numunenin analizini yapana küçük kapasiteli laboratuarlar için uygun bir cihazdır. 5 tip lökosit formülü ve retikülosit sayısını tam otomatik ölçen bir analizördür. WBC flow sitometrik, RBC ve PLT impedans direkt akım tayiniyle, hematokrit RBC pulse-height tayin metodu ile, retikülositler nükleik asit boyalar kullanılarak  flow sitometrik metodla, MCV ve diğer eritrosit parametreleri(MCH, MCHC, RDW, MPV gibi) ölçülen parametrelerden hesaplanarak ölçülmektedir(198).

 

3.5.17.2.2.2.4. Sysmex XE- 2100

 

Sysmex XE-2100 cihazı, tam otomatik rastgele seçimli(random Access) ve saatte 150 numunenin analizini yapma kapasitesine sahiptir. Lökosit alt tipleri, anormal flaglar ve otomatik retikülosit ölçen tam otomatik bir analizördür. CBC/retik modunda otomatik retikülosit sayımı yapabilir bu mod açık olduğu zaman lökosit sayımlarında otomatik düzeltme yapabilir. Lökosit sayımı ve anormal flag işaretlerini litik ajanlar kullanarak flow sitometrik olarak ölçer. NRBC sayımı hem spesifik litik ajanlar hemde floresan boyalar kullanılarak yapılır. Sysmex XE-2100 cihazında nRBC sayımı otomatik ölçülmektedir(216).

            Bu cihaz numune analizini yaparken farklı metodlar ve teknolojiler kullanır. Floresans flow sitometri metod ile lökosit, lökosit alt tipleri ve olgunlaşmamış hücreler, retikülosit ve retikülosit alt parametreleri ve Plt(O) ölçülür. Flow deteksiyon metodu ile RBC+Plt+Hct parametreleri, SLS Hemoglobin metodu ile hemoglobin ölçümü yapılır. Sysmex XE-2100  cihazıayrıca olgunlaşmamış hücre (Immature granulocyte cell) ve kök hücre bilgilerini,  IMI Scattergram olarak verme özelliğine sahiptir. Sysmex XE-2100 cihazı, parametrelerinin ölçümünü “Absolute Measurement”(gerçek ölçüm) esasına göre yapar. Sysmex XE-2100 cihazına opsiyonel olarak otomatik lam hazırlayıcısı(slide maker) ve lam boyama modülü(slide stainer) entegre edilebilir8289-290).

Sysmex XE-2100 cihazında ayrıca retiküllü trombositler (olgunlaşmamış trombosit fraksiyonu(IPF) ve retikülosit hemoglobin eşdeğeri (RET-He) ölçülmektedir. IPF trombopoezin indexi olarak da ifade edilir. IPF, iliğin trombopoetik aktivitesi ile ilişkili olan trombosit populasyonunun en küçük olgun bileşenlerini ölçer. IPF, trombositopeninin orjininin kemik iliği yetmezliğinde mi yoksa  periferik trombosit tüketiminden veya yıkımından ayırmada yardımcı olan bir testtir(290). Trombosit üretim hızının hızlı bir göstergesi olan IPF % olarak ifade edilir. IPF ve RET- He Master software’ini kullanarak Sysmex XE-2100 cihazında ölçülür. RET-He ortalama retikülosit içeriğini pikogram düzeyinde direkt olarak ölçümünü sağlar. Bu cihazda ayrıca FDA onaylı hematopoetik progenitör hücre(HPC) parametresi ölçülmektedir(291). Bu G-CSF tedavisi olan hastaların monitorizasyonunda hızlı ve ekonomik bir parametredir.

 

 3.5.17.2.2.3.  Cell-Dyn Kan Sayım Sistemleri

 

3.5.17.2.2.3.1. Cell-Dyn 3000

 

Cell-Dyn 3000 tüm lökosit alt tiplerini ışık saçınım özelliklerine göre belirler (küçük açılı ileri ışık saçınımı, geniş açılı ışık saçınımı, ortogonal ışık saçınımı ve depolarize ışık saçınımı)(292). Cell-Dyn 3000 lökosit alt tiplerini saymak için Çoklu Açılı Polarize Saçınım Ayrımı(MAPSS) adı verilen teknolojiyi kullanan çok-parametreli bir hematoloji analizörüdür(50, 293). Lazer ışını geniş bir profil içerisinde şekillendirilir ve kuartz akış hücresine odaklanır. Bu hüzme şekli lazer hizalamasını diğer akış sitometrelerinden daha az kritik hale getirir. Kan lökositleri orijinaline yakın durumda koruyan ancak eritrositleri lazerde transparan hale getiren bir solüsyonda seyreltilir. Her lökosit için dört eşzamanlı ışık saçınım ölçümü yapılır. Sıfır derece öne açı esas olarak hücre büyüklüğü ile belirlenir. 10 dereceli ışık saçınımı, hücre yapısının ve karmaşıklığının bir göstergesidir ve bazofillerin tanımlanmasında ve tüm hücre popülasyonlarının ayrılmasında özellikle yararlıdır. 90 derece ışık saçınımı granüllü hücreleri ayırır ve lobularite olarak adlandırılır. Depolarize 90 derece ışık saçınımı büyük kristalimsi granüler yapılarına bağlı olarak eozinofilleri ayırır. Anormal hücreler büyüklüğe karşı karmaşıklık saçınım grafiklerinde özgün bölgelerde bulunur ve blastlar, varyant lenfositler, bantlar ve olgunlaşmamış granülositler gibi lökosit kuşku işaretlerinin belirlenmesine yardımcı olur.

 

3.5.17.2.2.3.2. Cell-Dyn 3500

 

Cell-Dyn 3500 küçük ve sessiz çalışan bir cihazdır. Cell-Dyn 3500, 0, 10 ve 90 derecelik açılarda hem impedans hem de lazer ışık saçınımını kullanır. Rutin WBC sayımı apertür impedans analizine dayanır ve WBC’nin doğrulanması için lazer optik kanalı kullanılır(294). Genişletilmiş lizis modu” yenidoğan örneklerinde yaygın bir durum olan lizise dirençli eritrositlerin enterferansını önleyen benzersiz bir özelliktir. İmpedans apertürü özgün bir von Behrens levhasına sahiptir ve bu levha RBC/PLT’in açıklıktan geçtikten sonra hücrelerin sensör bölgeye tekrar girmelerini önler.

 

3.5.17.2.2.3.3. Cell-Dyn 4000 ve Cell-Dyn Saphire

 

 Abbott’un en son hematoloji analizörü Cell-Dyn 4000 birçok özgün ek özelliğe sahiptir. Otomatik rastgele seçimli analizördür. Cell-Dyn, basit kalibrasyon işlemleri  gerektiren ve kullanımı basit ve FDA onaylı bir cihazdır(218, 295). Monoklonal antikor testleri tam otomatik olarak yapılmaktadır. Bu cihaz oldukça ekonomiktir ve temel özellikleri nedeniyle klinik yararı oldukça önemlidir. Retikülositlerin floresan tayini tam otomatik,  rastgele seçimlidir ve nRBC floresan DNA boyanması lökositlerin kesin ve doğru sayımını sağlar ve nRBC sonuçları rapor edilebilir. Trombostiler hem optikal hemde empedans metodu ile ölçülür. Argon-iyon-lase ışık saçınım ölçüm yöntemi (MAPPS teknolojisi ) ve sabit –akımlı impedans, iki renkli flow sitometri ile kombine olması temel özelliklerini oluşturur. Üst modeli Cell-Dyn Saphire  basit , otomatik, basıt kullanımlı ve basit kalibrasyon işlemleri olan bir cihazdır(206 ) Gelecekte hematoloji analizöründe rutin monoklonal analizler yapan gerçek diagnostik bir cihaz olacaktır. 3 renkli floresans teknolojisi(MAPPS) ile hücre sayım  kesinliğini arttırır. Bu teknoloji; lökosit, lökosit alt tip sayımı, anormal hücrelerin, interefere edici maddelerin ve nRBC’lerin tanımlanmasında ilk basamaktır. Ayrıca trombosit kümeleşmesinin kesin olarak tanımlanmasında kullanılır ve lökosit alt tip sayımını  interfere eden çekirdekli eritrositler, kümeleşmiş trombositler ve debrisi uzaklaştırarak sonuçların güvenliğini arttırır.

İç dizaynı servis ve  bakımı minimize ederek güvenilirliği arttırır.Bu cihaz yüksek kapasitlei laboratuarlar için uygundur.

Total lökosit ve lokosit alt tip sayımınında rezistans eritrositleri güçlü litik metod kullanarak elimine eder. Rezistans RBCler varlığında rezistans RBC modunu kullanarak lökosit sayımları için manuel doğrulama ve periferik yayma gerekliliğini azaltır.

Bu sistemde retikülositler 3 renkli floresans flow sitometrik yöntemle otomatik olarak ölçülür. Bu yöntemle retikülosit populasyonundan lökositoz varlığında trombositler ve olgun eritrositler mükemmel ayırt edilir. Olgunlaşmamış retikülosit fraksiyonu da floresans metotla  ölçülür. Kırmızı floresans kullanılarak her örnekte nRBC otomatik olarak analiz edilmektedir. Ayrıca çekirdekli hücre alt populasyonların sayılmasıyla düzeltilmiş lökosit sayısı gerekliliği elimine edilir. Cell-Dyn Saphire cihazına opsiyonel olarak otomatik lam hazırlama(slide maker) ve lam boyama modülü(slide stainer) entegre edilebilir.

 

 

 

 

 

3.5.17.2.2. 4. Cobas Kan Sayım Sistemleri

 

Cobas Helios analizörü akış sitometrisi ve ışık saçınım teknolojisini kullanır ve diğer sistemlere göre bant nötrofillerini biraz daha iyi tayin eder. Doğruluk ve kesinliği diğer lökosit ve eritrosit parametreleri  ile benzerdir(296).

1980’lerin ortalarında ABX, Roche Diagnostics firmasına aitti ve Cobas adı altında bu firma tarafından dağıtılıyordu. 1996’da ABX ile birlikte Horiba (partikül sayım cihazlarının önde gelen Japon üreticisi) ABX’i satın aldı. Üretimdeki güncel ürünler PENTRA 60 (tam CBC, beş bölümlü diff ve saatte 60 örnekte 27 parametre), PENTRA 120 (29 parametre, saatte 120 örnek) ve PENTRA 120 RETIC’dir (12 retikülosit parametresi dahil 38 parametre, saatte 120 örnek ve PENTRA DX 120  (saatte 120 örnek, 45 parametre).

 

 3.5.17.2.2.4.1. ABX Sistemleri

 

Vega analizörü hücre analizi için sitokimyasal, impedans, absorbans ve flow cytome(hidrodinamik akış) tekniğini kullanır. WBC’ler, RBC’ler ve trombositler  elektriksel impedans tekniği ile ölçülür. Eosinofil reaktifi ile eozinofil granülleri boyanır ve çekirdekli hücreler fikse edilir. Bazofiller diğer lökositlerin basolyse reaktifi ile parçalanmasından sonra ayrı bir odacıkta elektriksel direnç ile tayin edilir(48,75).

Yeni sistem PENTRA DX 120 cihazı kan sayım hücrelerinin ölçümü için sitokimyasal, impedans, absorbans, flow sitometri ve florometri ölçüm teknolojisini kullanır. Flow sitometri ve sitokimyasal özellikleriyle beraber  double diff matrix teknolojisinin birleştirerek granülosit , lenfosit ve monositlerin  olgunlaşmamış formlarının(band) kantitatif olarak tanımlanmasını sağlar. Lökosit alt tip ve retikülosit sayımında fokuslanmış impedans ve absorbans teknolojisini birleştirerek(DHSS) önce flow sitometrik daha sonra seri ölçüm yapılır. Retikülosit sayımı için ileri saçınım(90 derece) lökosit sayımı için ise ışık transmisyonu özelliğini kullanır. Lökosit alt tip sayımı için önce lökositler stabilize edilir sadece eosinofiller boyanır. Her bir hücre sayımı  için 3 metot uygulanır. Bunlar  sitokimyasal, flow impedansı ve optik ölçüm tekniğidir. En son olarak matrisin tanımlanmasıyla hücreler tayin edilir. Büyük olgunlaşmamış hücreler ve atipik lenfositler yüzde ve mutlak sayı şeklinde verilir. Böylece manuel olarak incelenen periferik yayma azaltılmış olmaktadır. Pentra DX 120 cihazında  NRBC  direkt ölçülmekte ve lökosit sayımı için otomatik düzeltme yapılmaktadır. Bu modellerine slide maker ve slide stainer sistemleri entegre edilebilir. Pentra DF 120 cihazına opsiyonel olarak slide maker ve slide stainer mödülü entegre edilebilir.

 

3.5.17.2.2. 5. BAYER Kan Sayım Sistemleri

 

3.5.17.2.2.5.1. BAYER ADVIA 120

 

Bayer ADVIA 120, 24 saat çalışabilen, tam otomatik, sürekli seçmeli ve sürekli yüklemeli bir cihazdır. Saatte 120  CBC/Diff tayini yapar. Büyük, berrak bir plastik sıvı devre bloğunu içeren uni fluidics(UFC) teknolojisi, tubing sistemini en aza indirir. Bu sistem güvenirliği daha da arttırır. UFC sistemi ile hortumlardan kurtularak minimum bakım ve mikrolitre düzeyinde reaktif kullanabilme avantajı vardır. Tüm vucüt sıvılarında [(Plevra, Periton, Perikard, Beyin Omurilik Sıvısı(B.O.S)] ve kemik iliği aspirasyon sıvı analizleri FDA onaylıdır. Tüm hücrelerin sayımında laser ışık saçınım teknolojisini kullanır. Hücre morfolojisinin tayininde referans peroxidase ve oxasin 750 sitokimyasal boyalarını kullanır.

CBC parametrelerini unifludics, flowcell teknolojisi ve laser optik ölçüm teknolojisi ile hemoglobin düzeyini laser-optik ve kolorimetrik yöntemle, lökosit alt tip parametrelerini laser optik ve peroksidaz boyama metodu ile retikülosit parametrelerini ise laser optik  ve Oxacin 750 boyama metodu ile  ölçer. Lökositler eritrositlerin lizis edilmesinden sonra iki kanalda peroxidase ve basofil/lobularite kanlında  analiz edilerek sayılır. lökosit, lökosit alt tipleri ve boyanmamış büyük hücreler yüzde ve mutlak sayıları peroxidase kanalında yapılır. Ayrıca bu kanalda lökositlerin ortalama peroxidase aktivitesi ölçülür(297).

Bayer ADVIA 120’nin üst modeli 2120 cihazına opsiyonel olarak slide maker ve slide stainer mödülü entegre edilebilir.

 

3.5.18. Klinik Veteriner Hematoloji

 

            Tam kan sayımı veteiner tıbbi pratiğinde kullanılan rutin tanısal bir prosedürdür. CBC sayımlarına isteklerin artmasından dolayı birçok veteriner laboratuarı uzun zaman alan ve yoğun emek isteyen manuel hücre sayım metotlar yerine otomatik cihazları kullanmaya başlamıştır. İlk cihaz hücre sayılarını hızlı ve doğru sayan impedans teknolojisine dayanan teknolojidir. Ançak bu metot hücre morfolojisi hakkında detaylı bilgi vermemektedir. Son on yılda  impedans teknolojisindeki gelişmelerle yeni çeşitli hematolojik parametrelerle  sonuçlanmıştır. Ançak bu teknoloji sınırlı sayıda hücre morfolojisini değerlendirebilir.Çünkü birçok otomatik hematolojik analizör insan kanı analiz edecek şekilde geliştirildiğinden bu cihazların veteriner laboratuarlarına adaptasyonu için her bir hücre tipinin türlere göre değerlendirilmesi gerekir. Laser-metodu ile ölçüm yapan hematoloji analizörlerinde  hücre tiplerini türlere göre adaptasyonu için cihaz ayarlarını otomatik olarak ayarlayan software paketiyle başarıyla yapılabilir. Ançak her laboratuar her bir test tipi için sonuçların güvenirliğini ve doğruluğunu hem normal hemde anormal hastalığı olan hayvanlarda tayin etmelidir. Ançak bu büyük yatırım ister. Ayrıca hem hücre morfolojisinin ölçmek hemde kediler gibi bazı türlerin  referans değerlerinin tayinlerinde yeterli miktarda kan almak oldukça zor olduğundan  bu tür çalışmalar bu alanda çalışan insanların cesaretini kırmaktadır(298).

            Klinik veteriner pratiğinde hematoloji analizlerini yapmanın birçok avantajı vardır.bunlar;

  • Örnek toplanmasının kontrolu; analiz için kullanılan örneklerin elle doğru toplanması ve gerekrise yeniden örnek alabilme imkanı olmaktadır.
  • Taze örneklerin bulunabilinir olmasıyla örneklerin bozulmasından hatalı sonuçlardan kaçınılır.
  • Acil tanısal bilgiler  sağlar(tedavi ve sevk için belirtiler sağlayarak müşteriye  zamanında konsültasyon için bilgi verilir.

            Hematoloji analizleri tek başına birçok yararı vardır. Ayrıca uygun örnek toplanması ve cihaz bakımı gereklidir. Cihazların doğruluğunun kanıtlanması dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Tam kan sayımı, analizlerinde altın standart tekniği olarak tanımlanan manuel metotlar zahmetli ve doğru sonuçlar elde etmek için teknik yeterlilik ve uzmanlık gerektirir. Lökosit alt tiplerini saptamak hematolojik analizlerinde enzor görünmektedir. Manuel alt tip sayımlarında manuel yaymalarda hücre saymı sınırlıdır. Tipik olarak 100 hücre sayılır  ve binlerce hücre sayan otomatik cihazlarla karşılaştırılır. Yaymaların mikroskopik incelenmsi eğitimli kişiler tarafından bakıldığı için doğruluk seviyesi yüksek ve periferik yaymaların görünüşü klinikle ilişkisine bakıldığında subjektifliğinin derecesi çok geniş olacağından teşhis tutarlıdır. Örneğin bandların bulunması(olgunlaşmamış nötrofiller otomatik analizörlerde genellikle sıkılıkla monosit olarak tanımlanırlar, sağa veya sola kayma(nötrofiller), çekridekli eritrositler(otomatik sistemlerle eritrositler lizisini takiben lökosit olarak sayılırlar. Olgunlaşmamış ve patolojik hücreler(sıklıkla otoamatik sistemlerde yanlış kategorize edilirler), doğru eritrosit morfolojisi, trombosit yeterliliği gibi(özellikle dev ve aggerege trombosit populasyonları sıkılıkla  kedigil  örneklerinde görülür) durumlar

Endüstri ve uzmanlar özellikle durumu çok kötü olan hastalarda periferik yayma yapılarak mikroskopik olarak değerlendirilerek doğrulanmasını önermektedirler.

            Bügünlerde veteriner kliniklerinin çok yoğun olduğu için otomatik hematolojik cihazlar açıkça istenmektedir. Veteriner kanının az olmasından dolayı otomasyonda kullanılan metotların doğruluğunun yapılması gereklidir. Kalitatif spesifik kapiller tüplerinin(QBC,IDEXX laboratuarları) kullanımınıyla ilerleme kaydedilmiştir. Kan sayımında kullanılan kalitatif sistemler  ortalama hücre büyüklüğüne dayanmaktadır. Çünkü hücreler aslında sayılmaz, doktorlar bu cihaların sonuçlarının normal ve iyi hastalarda oldukça doğru olduğunu sanmaktadırlar. Ançak sonuçlar hastalarda tamamıyle geçersiz olabilir.

Otomatik hematolojide impedans ve laser flow sitometri doğruluğu ortaya koyulmuş iki iyi metottur. Gerçekten  bazı üreticiler her iki teknolojiyi bir sistemde etkili bir şekilde kullanmaktadırler (Advia 60 ve Cell Dyne 3500 sistemleri). Bu sistemler bügün veteriner kliniklerine göre geliştirilmiştir. İmpedans metot veya coulter metotu olarak adlandırılan mettot şöyledir.; elektrik olarak nötral olan kan hücreleri apertürden geçerken elektriksel bir pulse oluşturular. Hücre sayımı; kanın belli volümünün set edilen sürenin üzerinden ölçülen birçok sayıdaki pulsların sayısından tayin edilir. Elektriksel iletkenliğin azalışı ölçülen hücre volumuyle orantılıdır. Bu hücre ayrımı çeşitli lizis ajanlarıyla temel hücre tiplerininni (eritrosit, lökosit, ve trombosit) birbirinden ayırır. Düzgün şekilde kalibre edildiklerinde oldukça güvenilir hücre sayısı, hemoglobin ve indeks değerleri verirler. Lökositlerin doğruluğu  her bir sistemin dizaynına ve uygun algoritmalara bağlıdır. İmpedans teknolojisi hücreleri iki metoda göre sınıflar. Lizis ajanı ve kütle büyüklüğüne göre sınıflar. Lizis miktarı ve zamanlaması güvenilir ayrıntılı sayım elde edilmesinde önemli rol oynayan bir basamaktır. İmpedans sayıcısının performansı, hücrleri sınıflandırılması ve etkili bir şekilde ayıran   türlere spesifik algoritmaların geliştirilmesıyle yükseltilebilir.

Lazer motodu ise hücre sayımı, ışık saçınımı ile hücrelerin ayırt edilmesi  ve hücrelerin sınıflandırılmasında kullanılan flow sitometrik bir tekniktir. Bu yaklaşımla hücrenin içine bakma yeteneği olarak tanımlanır ve böylece hücresel yapının farklılaşması gösterilir. Çeşitli boyalar kullanılarak tanımlanan hücre tiplerini  hüsrelerin farklılaşmasında ve hücresel inklüzyonlarnı(retikülosit gibi)  tanımlanmasında yardımcı olur. Bu  teknoloji Bayer  teknolojisinde  iyi tanımlanmıştır. Advia 120 lazer akış sitometri teknolojisini kullanan ve veteriner paketi olan bir cihazdır. Advia 120’nin veteriner aplikasyonu manuel metotolarla etkileyici bir korelasyonunun olduğu gösterilmiştir. Veterinerlik eğitimi veren  hastanelerde ve referans laboratuarlarında önemsenen çoğunlukla kullanılan bir cihazdır.

İleri hematoloji sitemleri veteriner örneklerin  ilginç yapılarından dolayı kolay etkilenir. Bunlar;

  • Kedigillerde lizise rezistans eritrositler,
  • Kedigillerde dev trombositler ve küme trombositoz,
  • Köpek ve benzeri hayvanlarda  lökosit büyüklüğünün(20-25 %) homojenliği,
  • Olgunlaşmamış/patolojik hücrelerin yanlış sınıflandırılması gibi problemlerdir.

 

Herhangi bir hematoloji sistemi satın almadan önce performansının doğrulanması  bu tür değişiklerin bilinmesi aktif rol oynar. Eğer veteriner kliniğinize bir cihaz almayı düşünüyorsanız bu sistemi değerlendirmek için ;

  • Cihazın çalışmasının kolay olmasına
  • Cihazın sonuç verme hızına
  • Gerekli örnek miktarına,
  • Cihazda mevcut türlere göre,
  • Cihazın bakım gerekliliklerine ve
  • Bilgisayar yönetimi gibi kriterlere bakılması önerilmektedir.

Daha sonra cihazın performansının doğruluğu, kesinliği ve prezisyonu sizin laboratuarınızda kontrol edilir. Sonuçlar referans laboratuar sonuçları ve manuel metolar(periferik yayma) ile karşılaştırılır. Geri elde edilebilirlik için; bir örnek birkaç kez çalıştıralarak kontrol edilir. Bulunan sonuçlar üreticilerle tartışılır. Herhangi bir uyumsuzluk varsa not edilmelidir. Laboratuvarınızda böyle validasyonlar yapmanız birçok kaliteli üreticileri  yüreklendirir vede sıklıkla yaptığınız bütün masraflar ödenir.

 

 

KAN SAYIM PARAMETRELERİ-7

PDFPrintE-mail

Written by selime Saturday, 28 June 2014 20:10

3.5. Lökosit ve  Lökosit Alt Tip Sayımı (Beyaz Kan Hücresi)

       (WBC VE Differential)

 

Lökositler manuel yöntemlerle veya otomatik hematoloji analizörleri ile sayılabilir. Lökositler manuel olarak eritrositleri parçalayan bir seyreltici (genellikle asit veya deterjan) içinde dilüe edildikten sonra sayılır. Dilüsyon lökosit sayısıyla paraleldir. Genellikle  lökopeni olgularında daha düşük, lökositoz olgularında daha fazla dilüsyon gerekir. Manuel sayımlar hemositometre veya sayım odacığı kullanılarak yapılır.( Şu bölümde detaylı anlatılmıştır) Eritrosit  sayımlarında olduğu gibi, manuel lökosit sayımlarında hata oranı yüksektir. Normal veya yüksek lökosit sayımlarında CV %6.5 iken, düşük lökosit  sayımlarında CV %15’dir. Otomatik yöntemlerde CV %1-3 civarındadır(86,88). Otomatik lökosit sayımları kriyoglobulinler veya kriyofibrinojen(221), trombosit agregasyonu(135) veya eritrositler yeterince parçalanmadığında yalancı yüksek sonuçlar verebilir ve manuel sayım gerekebilir. Yüzey immünglobulin etkileşimlerine sekonder granülosit aglütinasyonuna bağlı olarak yalancı düşük nötrofil sayıları bildirilmiştir(222).