Developed by JoomVision.com

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

HEMATOLOJİ LAB HEMATOLOJİ LAB

GTranslate

English French German Italian Portuguese Russian Spanish
Developed by JoomVision.com

HEMATOLOJİ LAB

PERİFERİK YAYMA İLE İLGİLİ BİLMENİZ GEREKENLER

PDFPrintE-mail

Written by selime Saturday, 28 June 2014 20:16

3.5.3. Periferik Yayma İnceleme Protokolü(NCCLS)

3.5.3.1. Periferik Yayma Hazırlama

3.5.3.1.1. Referans Metot (213)

  1. Temiz, kuru ve toz içermeyen 25 x 75 mm (1 x 3 inç), 0.8 x 1.2 mm kalınlığında, kaliteli, cam mikroskop lamı üzerinde her bir örnekten üç yayma  hazırlanır. Lamlar A, B ve “yedek” olarak etiketlenir. İki yayma prosedür için kullanılacak ve üçüncüsü yedek olarak saklanacaktır. Kan lökopenik ise, daha fazla sayıda kan yayma örneği hazırlanmalıdır.
  2. EDTA içerisine alınan venöz kan örneği veya deriye giriş yoluyla alınan kan ile yaymalar hazırlanabilir(Şekil 44/A). Yaymalar alındıktan sonra 4 saat içinde yayılmalıdır. Kan buzdolabında saklanmamalıdır. Periferik yayma hazırlamadan önce kanı elle 20 kez alt-üst etmek gereklidir.
  3. Periferik yaymalar  lam (kama) metodu ile hazırlanır. İyi karışmış kanın bir  damlasını (yaklaşık 0.05 mL) cam mikroskop lamının bir ucuna yakın yere koyulur. İkinci, kenarları cilalanmış daha dar yayma lamını yaklaşık 45 derece açıyla tutulur ve hemen kan damlasının üzerine doğru çekilir. (Şekil 44/B) Kanın lam boyunca yayılması sağlanır. Daha sonra yayıcı lamı lamın diğer ucuna doğru hızla ve düz olarak, kanı arkasına doğru çekecek şekilde itilerek hazırlanır(Şekil 44/C-D)

 

A. Parmak Ucundan Kan Örneğinin Alınışı

 

 

 

 

 

 

B. Kan Örneğinin Lam Üzerine Konulması

 

 

 

 

 

C. Yaymanın Lam Yöntemi İle Yapılması

 

 

 

 

 

 

 

 

      D.İyi Hazırlanmış Yayma Örnekleri

       Şekil 44. Periferik Yaymanın Lam Metodu İle Hazırlanması

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. Yaymayı hazırladıktan sonra bir saat içerisinde fiksatif içeren Romanowsky boyası ile boyanır veya daha sonra boyama için “su içermeyen” (< %3 su) metanol ile bir saat içerisinde fikse edilir. Yaymanın arkasının mavi boyanmasını önlemek için,  yaymalar hazırlandıktan sonraki birkaç saat içinde boyanmalı veya boyanmadan saklanmaları gerekiyorsa fikse edilmelidir. Fiksasyon ve boyama lamların reaktif ile doldurulmuş kavanozlara daldırılmasıyla veya yatay olarak desteklenmiş lamların veya lamellerin reaktifle kapatılmasıyla yapılabilir. Ançak bu yöntemde çok fazla boyanan yaymanın kapatılması buharlaşmayı önleyeceği için çökelmelere neden olabilir.
  2. Boya yatay lamdan su ile yıkanarak uzaklaştırılır. 30 saniyeden daha uzun süreyle yıkama mavi boyanmayı azaltır. Lamın arkası gazlı bezle silinir.
  3. Lam eğik pozisyonda ortam havasında kurumaya bırakılır.

 

3.5.3.1.2. Yaymalarda  Aranan Özellikler

 

1. Yeterli çalışma alanı olmalıdır.

2. En az 2.5 cm uzunluk; lamın ucuna göre en az 1 cm geride sonlanmalıdır.

3. Kalınlıkta dereceli azalma (kalından inceye); kare veya düz kenarda sonlanmalıdır.

4. Çalışma alanı içerisinde kabul edilir morfoloji olmalıdır.

5. Yaymanın  yayıldığı lamdan daha dar olan lam düz ve süreklilik sağlayacak şekilde yayılmalı ve alanlar imersiyon incelenmesinde kolay bulunmalıdır.

6. Teknik artefakt oluşturmamalıdır

7. Minimum dağılım hatası olmalıdır.

8. Giderek incelen en uç kısım; tümsek, çukur veya pürüz olmamalıdır; bunların tümü bu bölgeye giden lökosit sayısındaki artışı gösterir.

Anemi veya polisitemi olgularında ya da anormal plazma proteinlerin (örn, miyelomda, soğuk aglütinin hastalığında) bulunduğu olgularda periferik yaymaların çok uygun olarak hazırlanmadığı görülmüştür.

 

3.5.4. Periferik  Yayma Sayım Prosedürü

3.5.4.1.Referans İşlem

 

1. Bu inceleme için “mazgal” sistemi kullanılır(Şekil 45). Tanımlanan her hücre aşağıdaki kategorilere yerleştirilmelidir: nötrofil, segmentli; nötrofil, bant; lenfosit, normal; lenfosit, varyant; monosit, eozinofil; bazofil; diğer çekirdekli hücreler (çekirdekli kırmızı hücreler dışında). Belirgin biçimde tanımlanabilen şekli bozulmuş hücreleri uygun sınıfa yerleştirilir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

   Şekil 45. Periferik Lamlarda Sayım Tekniği Gösterilmektedir.Lam Metodu İle Hazırlanan Periferik

 

 

 

 

 

 

“Yaymaların İnceleme Alanları . Oklar İnceleme Alanını(İnce Uç) Göstermektedir.

 

2. Her lamda 200 lökosit sayılmalıdır. Kan lökopenik ise, paralel olarak ek lamlar incelenmelidir.

3. Alt tip sayısı sonuçlarını fraksiyon cinsinden olarak ifade edin (sayılan tüm lökositlerin yüzdesi).

4. Mevcut çekirdekli eritroid hücreleri sayılır ve sonuc sayılan 100 lökosit başına düşen sayı olarak belirtilir.

 

3.5.5. Periferik Yaymanın Mikroskopik İncelenmesi

3.5.5.1.Referans Metot

 

Lökositleri Romanowsky tipi boyalar ile boyanmış  yaymalarda incelemeden önce kişi yaymanın iyi hazırlanıp hazırlanmadığını, hücre dağılımının homojen olup olmadığını ve hücrelerin tatmin edici şekilde boyanıp boyanmadığını belirlemelidir.

1. Kan yayması ilk önce küçük büyütme ile (10x- 40x objektif) incelenmeli ve hücre dağılımı, sıradışı veya anormal hücreler ve boyamanın yeterliliğine bakılmalıdır. 100 x yağ imersiyon objektiflerinin çoğu sitoplazmik granülleri ve nötrofilik filamentleri  göstermek için kullanılır Bu objektifde lökosit sayımı da yapılabilir ve blastlar veya çekirdekli kırmızı kan hücreleri gibi anormal hücre unsurları taranabilir. Yaymanın kenarlarında yoğunlaşabilecek anormal popülasyonların atlanmaması için tüm kan yaymasının taranması önemlidir. Yağ imersiyon merceğinin (50 veya 63 x) kullanımı lökosit alt tip sayımları için genellikle yeterlidir ancak 100x yağ merceği hücre inklüzyonları veya sitoplazmik granüllerin incelenmesi için gerekebilir. Tüm hücre tiplerinin incelenip tanımlanabilmesi için kan yaymasının sistematik değerlendirmesi şarttır. Her hücre tipi hem kantitatif hem de kalitatif anormallikler açısından değerlendirilmelidir. İlk önce lamın sayım bölgesi, monositlerin, nötrofillerin ve büyük anormal hücrelerin   eğilim gösterdiği lateral ve ince sivri kenarlar gözden geçirilir(Şekil 34). Kuşkulu hücreler 100x büyütmede saptanır ve yüksek büyütmede doğrulanır. Çekirdekli kırmızı hücreler, makrofajlar, olgunlaşmamış granülositler, olgunlaşmamış lenfoid hücreler, megakaryositler ve anormal hücreler kanda normalde bulunmadığından, bunlar varsa kaydedilir(Şekil 46).

2. İnceleme eritrositlerin yaklaşık %50’sinin düzgün dağıldığı  bölgeye doğru genişletilir ve eritrositler periferik yaymanın ince uç adı verilen  kısmında incelenir(şekil 47). Normal bir hasta örneğinin inceleme alanında, eritrositlerin ortalama büyüklüğü (oküler mikrometre kullanılarak en uzun ve en kısa çapların ortalamasıyla ölçülür) 0.3 mikrometre ve standart sapma 200 civarında sabit olmalıdır ve komşuluklarıyla birlikte tekli eritrositler 0.6 mikrometreyi aşmamalıdır.

3. Total lökosit sayısı litrede 4 x 109  olduğunda, kabul edilebilir çalışma alanında ve en az 300 lökosit olmalıdır.

4. Nötrofiller, monositler ve lenfositler yaymanın “kullanılabilir” alanlarında eşit dağılmış olmalıdır.Toplam lökosit sayısı normal sınırlarda olduğunda, uç taraftaki 100x alanda bulunan lökosit  sayısı yaymanın tamamında alan başına düşen sayının 2-3 katından fazla olmamalıdır. Yan kenarlar yaymanın tamamına göre 100x alan başına düşen hücre sayısından 2-3 kat daha az hücre içermelidir.

 5. Patolojik durumlar (örn., kronik lenfositik lösemi) ile ilişkili belirli formlar dışında, lökositlerin %2’den azı parçalanmış veya tanımlanmamış formlar olmalıdır. Sadece parçalanmış hücre hala belirgin biçimde saptanabiliyorsa (örn, eozinofil) alt tip sayımına dahil edilmelidir. Tanımlanamayan parçalanmış hücreleri (sepet hücreleri vs.) “diğer” kategorisinde sınıflanmalı ve laboratuar raporuna açıklama yapılmalıdır.

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 46. Lamın uç kısımlarında(mor renkli)

büyük hücreler, trombosit kümeleri, mikrofilamentlere bakılır

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 47.Lamın gövde kısmında(mor renkli kısım) rulo

formasyonu ve eritrosit aglütinasyonuna bakılır

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 48. Orta kısımda (mor renkli kısım) hücre morfolojisi incelenir ve tahmini lökosit ve trombosit sayısı

 hesaplanır.

 

 

Sayım kaydı mekanik veya elektronik çizelge kullanılarak yapılabilir. Sınıflanamayan lökositler “tanımlanamamış” grubuna yerleştirilmelidir. Bazı durumlarda (özellikle lösemi) tanımlanmamış pek çok lökosit olabilir. Lökosit alt tip sayım prosedüründe eritrositlerin ve trombositlerin morfolojisi incelenir ve trombositlerin sayısı hesaplanır(Şekil 48 ).

Her bir lökosit tipinin mutlak konsantrasyonu, onun yüzdesi ile total lökosit sayısının çarpımıdır. Mutlak konsantrasyonda artış mutlak artıştır; yüzdede artış relatif artıştır. Örneğin, düşük total lökosit sayısında nötrofil sayısı normal (yüzdesi normal) olabilir  ancak mutlak sayısı azalmış olabilir. Referans aralıkları yüzdeler yerine mutlak konsantrasyonlar şeklinde verilmelidir.

 

3.5.6.Periferik Yaymayı İnceleyen Kişinin Özellikleri

3.5.6.1. İnceleyen Kişinin Deneyimi

 

Olgunlaşmamış ve anormal hücre morfolojisini inceleme deneyimi ve eğitimi şarttır. İnceleyen kişi tüm yaygın lökositleri sınıflayabilmeli ve hem konjenital hem de edinsel lökosit varyasyonlarının çoğunu bilmelidir(213). Periferik yayma inceleyen kişi eğer bir  yayma için 200 hücre sayıyorsa bu kişinin bir günde bakabileceği periferik yayma sayısı 15-25 arasında olmalıdır.

 

3.5.6.2.Yasal Konular

 

Lökosit alt tipleri Klinik Laboratuar İyileştirme Düzeltmeleri 1988 (CLIA-88)’i uygulamaya koyan yönetmeliklerde “orta derecede karmaşık” şeklinde sınıflanır.  Ancak atipik ve anormal hücrelerin tanımlanması orta karmaşıklıktan yüksek derecede karmaşık teste kadar değişir. Periferik yayma incelemelerini yapan herhangi bir laboratuar veya diğer test merkezi bu tip testlere ilişkin Sağlık Bakım Finansman Kurumu (HCFA) yönetmeliklerinin tümüne uymalıdır; bunlara kalite kontrol ve uzmanlık testi programlarına katılım dahildir. Ayrıca, HCFA tüm personel için yeterlilik testini şart koşmaktadır.  

Birçok birinci basamak uzmanlarının temsilcilerini içeren bir komite toplantısında yazarlar yorumun “uygun eğitim ve deneyime sahip bir hekim” tarafından yapılması gerektiğini belirtip şu ifadeyi ekliyorlar: “Hekim sayısal ve morfolojik bulgular belirli bir klinik zemindeki konuyla ilgili diğer bilgiler ile birleştirir.” Ançak deneyime sahip olduğu kabul edilen ve hastanın klinik bakımında yer alan hekimlerin uzmanlık veya uzmanlıklarına değinilmemektedir. Birinci basamak uzmanlar artık uzman görüşleri bildirmek için gerekli deneyim ve eğitim şartlarını karşılamamaktadır. Tıp fakültelerinde yayma morfolojisi eğitimi olmadığından ve asistanlık programları yayma yorumlanmasında örneğin röntgen veya EKG yorumu ile aynı düzeyde eğitim vermemektedir.

Günümüzde hematoloji laboratuarında yaymalar teknisyenler tarafından gözden geçirilmekte  klinisyenler yaymaları gözden geçirmemekte ve  hatta teşvik edilmemektedir; bunun  sonucu, birinci basamak uzmanlarının yayma yorumlamalarına duyulan  güven azalmakdatır. Hatta aslında birçoğu laboratuar bulgularını tanı sürecine uygulama konusunda bile zorluk yaşamaktadır.

Hematologlar ve laboratuar uzmanları için eğitim ve devam eden deneyim klinik ilgi ve günlük çalışmaya bağlı olarak son derece değişken olabilir. Alt uzmanlıklar giderek daha da alt uzmanlık konularında uzmanlaştıkça  yeterlilik için günlük gereken sayıda konu materyaliyle  karşılaşılarak kolaylıkla ortadan kalkabilir. Otomasyon ve yeni teknoloji yayma ve kemik iliği morfolojisinin rolünü giderek azaltmaktadır. Örneğin, akış sitometri hücre fenotiplemesiyle lenfosit morfolojisinin nüansları konusu üzerinde ne kadar durulabilir?

Şu anda zorluk tanı sürecini desteklemek için tüm klinik ve laboratuar bilgilerinin nasıl birleştirileceğidir. Uzman veya hematolog hastanın tanı ve tedavisi için gereken klinik bulgularda anahtar rol oynar ancak laboratuar konusunda söyleyeceği çok az şey vardır. Klinik patolog klinikten/hasta yatağından uzaklaştırılmıştır ve klinisyenin sağladığı çok az klinik veriye dayanmaktadır. Bunun cevabı eski kültüre geri dönmekte yatıyor gibi görünmektedir: laboratuar uzmanı  ile görüşmek üzere klinisyen laboratuara rutin ziyaretlerde bulunmalı, mikroskobun başına oturmalı ve olguları hem klinik hem de laboratuar perspektifinden gözden geçirmelidirler. Bu tip bir etkileşim olmadan hatalı tanı, yanlış tedavi veya en azından ek laboratuar analizlerini doğru şekilde planlamada başarısızlık riski sözkonusudur.

 

3.5.7. Periferik Yaymada İzlenilecek Yollar

 

Kan hücre incelemesi genellikle otomatik hematoloji cihazlarından başlayarak ardışık sırayla yapılır. Kantitatif ve/veya kalitatif anormallikler saptandığında örnekler ek analiz için seçilir. Kantitatif anormallikler hücre sayısı veya şeklinde sınırların dışında kalan değerleri veya cihazın yaptığı lökosit alt tip sayımındaki anormal değerleri içerir. Kalitatif anormallikler bazı sonuçların yanlış olabildiğini veya anormal hücre tiplerinin var olabildiğini gösteren alarm işaretlerini içerir. Bazıları klinik koşullarda beklenen değişiklikleri yansıtır; örneğin, yenidoğana karşı geriatrik hasta, hastanede yatan hastaya karşılık poliklinik hastası, travmaya karşılık transplantasyon hastası. Diğerleri klinik dikkat gerektiren tıbbi durumları gösterir.

Otomatik kan sayım sitemlerinde önemli bir konuda analizörlerin yalancı pozitif ve yalancı negatif sonuçlar vermesidir. Yalancı anormal sonuçlar tanımlanabilir ve ek, gereksiz testleri ortadan kaldırır. Önemli olan konu, bir otomatik analizöründen elde edilen normal bir sonucun kalıtsal veya edinsel hematolojik ya da başka bir hastalık olasılığını dışlamamasıdır. Bunlar laboratuarların ve diğer test merkezlerinin formel periferik yayma gözden geçirmesi prosedürlerine uymalarının diğer iki nedenidir.

Otomatik sayan cihazların tümü lökosit alt tiplerini hassas ve etkin biçimde incelenmesini sağlar ancak bazı durumlarda cihaz işaretleri teknisyenin gözden geçirmesi gerekebilir. Cihaz işaretleriyle ilgili kaygılar nedeniyle, her laboratuar kendi periferik yayma inceleme kriterleri için  bir politika belirlemelidir. Payne tarafından önerilen periferik yayma inceleme kriterleri Tablo 24’de gösterilmiştir(228).

 

 

 

 

 

Tablo 24. Periferik yayma inceleme kriterleri için  önerilen alt  ve üst sınırlar

 

Değişken            

Alt Sınır

 Üst Sınır

 

Lenfositler (x109/L)     

<1.0                                               

>                       >50

 

Eritrositler (x1012/L)     

< 2.0

>8.0                  >8

 

Hemoglobin (g/L)

<50

        >200

 

MCV(fL)

<60

        >110

 

MCH(pg)

<20

        >37

 

MCHC(%)

<25

        >37

 

RDW (%)

 

        >20

 

Trombosit (x109/L) *    

<40

       >1000

 

 

          Veriler   Payne BA, et al.Am J Clin Pathol 1987; 88:51-57 alınmıştır. Trombosit Histogramının bazal seviyesine dönmemesi ve trombosit sonucu alınamaması durumunda  mutlaka periferik yayma  değerlendirilmesi yapılmalıdır.

 

Kan sayım cihazlarında lökosit alt tip sayımı yapan laboratuarların çoğu sayımların kabul mü edeceğini yoksa periferik kan yayması ile tarama mı yapacağını veya manuel sayım yapılarak doğrulanması mı gerektiğini belirleyen CBC ve förmül sonuçlarına dayanan prosedür limitlerine sahip olmalıdır(228).

Hiyerarşik sistemler test merkezleri arasında farklılık gösterir ve test personelinin deneyim ve eğitimini, otomatik analizörlerin gelişmişlik düzeyini ve belirli bir popülasyonda varyasyonların/anormalliklerin insidansını yansıtacak şekilde yapılandırılır. Bu tip hiyerarşik sistemler hangi kalitatif ve/veya kantitatif anormalliklerin periferik yaymanın mikroskopla kimin tarafından gözden geçirilmesi gerektirdiğini ortaya koyar . Anormallikler sıradışı, nadir veya tanı ve/veya tedavi için potansiyel olarak anlamlı olduğunda bir uzman yaymayı gözden geçirebilir.

Laboratuar sonuçlarının kalitesini artıran ve hasta bakımını iyileştiren, deneyimli uzmanın klinik bilgileri rakamsal ve/veya morfolojik anormallikler ile birleştirebilmesidir.

 

 

 

 

 

3.5.8. Periferik Yaymanın  Klinikte Kullanımı

 

 

Periferik yaymanın incelenmesi ve açıklayıcı bir raporun yayınlanması sitoloji laboratuarlarındaki standart labortauvar uygulamaları ile benzerdir. Önce kalifiye bir teknisyen ön tarama yapar ve daha sonra yeterli eğitim ve deneyime sahip uzman tarafından lamlar gözden geçirilir. Her laboratuar hangi lamların uzman tarafından gözden geçirilmesi gerekliliğini belirleyen  kriterler ortaya koymalıdır(228). Periferik yaymalara bakan uzmanlar sayısal ve morfolojik bulguları belirli bir klinik zeminde diğer bilgiler ile birleştirebilmelidir(229).

 

  • Periferik yayma gözden geçirilmesiyle çeşitli hematolojik ve diğer hastalıkların tanısı daha hızlı ve doğru konulabilir. Bunlar enfeksiyöz, konjenital ve edinsel bozuklukları ve maliniteyi içerir.
  • Periferik yaymadaki spesifik bulgular ek testleri yönlendirebilir ve gereksiz testleri ortadan kaldırabilir. Örneğin, önceden anemi teşhisi koyulan bir hastada eritrosit aglütinasyonunun saptanması muhtemel bir otoimmün hemolitik sürecin tanımlanması için ek çalışmaların yapılmasını gerektirebilir. Eritrosit  bulgusu rulo ise, ek çalışmalar myeloma gibi plazma hücre diskrazisine yönelik olacaktır. Benzer şekilde, fragmanlı eritrosit bulgusu mikroanjiyopatik hemolitik süreç, daha şiddetli megaloblastik anemi veya daha benign bir bozukluğu gösterebilir.
  • Periferik yayma bulguları farklı bir tedavi seçeneği gerektiren kuşkuya yer bırakmayan bir tanı ortaya koyabilir. Löseminin lenfoid yerine miyeloid olarak sınıflanması ve paraziteminin Babesia türü yerine Plasmodium enfeksiyonu olarak sınıflanması gibi iki örnek verilebilir.
  • Bazı olgularda tanıya gidilebilir ancak ek doğrulayıcı çalışmalar gerekir. Örneğin, erişkin bir hastada çekirdekli eritrositlerin varlığı aşağıdakilerden herhangi birini gösterebilir: yakın tarihte anlamlı kan kaybı, hemolitik süreç (konjenital (talasemi) veya edinsel (ciddi ısı hasarı), miyelodisplazi ve eritrolösemi. Eritrositlerde bazofilik noktalar eritropoezde bozulmayı gösterir. Bu bulgu çekirdekli eritrositler için listelenen tıbbi durumların herhangi birini gösterebilir ancak bir çocukta kurşun zehirlenmesi düşünülebilir. Bu eritrosit bulgularından herhangi birine sahip hastaya en iyi hizmet, bilgili laboratuar uzmanının laboratuar ve klinik bilgileri birleştirilmesiyle verilir.
  • Nihai klinik tanı ne olursa olsun, uygun ek çalışmalar başlatılabilir ve gerekirse tedaviye derhal başlanır .
  • Bazı olgularda hospitalizasyon en aza indirilebilir veya ortadan kaldırılabilir. Ayrıca maliyetler azaltılabilir, birinci basamak hekimin zamanı daha verimli kullanılabilir ve hastaya daha çok vakit ayırabilir.

 

Periferik yayma gözden geçirmesinin tanıda ve sonraki tetkiklerin yönlendirilmesinde önemli bir basamak olarak kabul edilmesine rağmen, deneyimli uzmanların yorumlarının katkılarının olduğu literatürler sınırlıdır. 1970-1999 yılları arasında yapılan medline taramaları genellikle  demir eksikliği anemisi, periferik kan yayması, tıp ekonomisi, hematoloji cihazları, kalite yönetimi ve klinik sonuçlar terimlerini içeren çok spesifik konulardı. Bu literatürler analizör sonuçlarını  periferik yayma yorumları ile klinik konular bakımından karşılaştırdı. Ayrıca bu literatürler klinik sonuçları bugünkü anlamında nadiren ele aldı.  Periferik yaymayı ne zaman ve neden gözden geçirmeli? Tek bir kriterler kümesi evrensel olamaz ve bu tip bir küme ekonomik açıdan kullanışlı veya akılcı olamaz. Herhangi bir kriterler kümesinin istatistikçileri, tedavi giderlerini karşılayan kurumları ve yasal yetkilileri tatmin etmesi de mümkün değildir. Daha da önemlisi, hasta popülasyonlarında ve test personelinin özellikleri konusundaki farklılıklar tek tip kriterler topluluğunun tanımlanmasını imkansız hale getirir. Periferik yayma gözden geçirmesi için hangi kriterlerin benimseneceği laboratuar direktörü  uzmanının tıbbi görüşünü gerektirir. Ancak hastanın çıkarları ile zamanı giderek daha da azalan birinci basamak hekimin ile aynı olmalıdır. Dolayısıyla bu karmaşık konuları çözmek  sağlık-bakım finansmanının güncel durumu ve değişkenliği göz önüne alındığında, bu uygulamaya geçmek  zor olabilir. Aşağıdaki iki tabloda çeşitli laboratuarlarda ve uygulamalarda elde edilen deneyimler, otomatik analizörlerin ve her düzeydeki tıp personelinin becerileri ile ilgili uzman bilgilerini, yasal yetkilileri, sigorta kuruluşlarını, yönlendirilmiş bakım organizasyonlarını, birinci basamak hekimleri ve en önemlisi hastaların kendilerini ilgilendiren konuları  yansıtmaktadır.

Periferik yaymanın gözden geçirilmesinin majör nedenlerini Tablo 25’de listelenmektedir. Bu tip bir gözden geçirme otomatik hücre sayımlarındaki kantitatif veya kalitatif anormallikler nedeniyle başlatılabilir. Uygun olduğunda,  periferik yayma gözden geçirmesi daha doğru ve hızlı tanı koyulmasını sağlayabilir. Laboratuar sonuçlarının kalitesini artıran ve hasta bakımını iyileştiren, deneyimli uzmanların klinik bilgileri rakamsal ve/veya morfolojik anormallikler ile birleştirebilmesidir. Ayrıca, fiziksel bulgular ve ayırıcı tanı gibi klinik konular önemli olduğundan, hastalardan doğrudan sorumlu hekimler Tablo 25’de listelenen hastalıklar için bir olasılık sözkonusu olduğunda uzman tarafından yapılan periferik yayma gözden geçirmesi istenmelidir. Periferik yayma gözden geçirmesi yapıldığında açıklayıcı rapor hazırlanmalıdır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tablo 25. Periferik Yayma Gözden Geçirme  Nedenleri

 

Kantitatif:

  • Trombosit sayımının doğruluğunu değerlendirmek
  • Analizör tarafından elde edilen alt tip sayımları yoksa veya geçersiz ise lökosit popülasyonlarının değerlendirilmesi veya doğrulanması
  • Hatalı sonuçlardan kuşkulanılıyorsa analizör sonuçlarının doğruluğunu kontrol etmek

 

Kalitatif:

  • Hematolojik malinite tanısı koymak: akut veya kronik lösemi
  • Hematolojik kök hücre hastalığına tanı koymak
  • Kronik miyeloproliferatif bozukluklar
  • Miyelodisplazi, primer veya sekonder (tedaviye bağlı)
  • Kalıtsal lökosit hastalığına tanı koymak (örn., May-Hegglin anomalisi)

 

Hem kantitatif hem de kalitatif:

  • Sitopenilerin değerlendirilmesi
  • Edinsel anemiler (örn. Hemoliz, karaciğer hastalıkları, kombine anemiler)
  • Edinsel trombositopeniler (örn. Disemine intravasküler koagülopati, trombotik trombositopenik purpura)
  • Paroksismal noktürnal hemoglobinüri
  • Plazma hücresi diskrazileri
  • Kalıtsal trombosit hastalıkları (örn., gri trombosit sendromu)
  • Kalıtsal hemolitik bozuklukların değerlendirilmesi
  • Hemoglobinopatiler, talasemiler (örn., Hb SS, beta-talasemi)
  • Enzim eksiklikleri (örn., G6PD eksikliği)
  • Membran defektleri (örn., kalıtsal sferositoz)
  • Enfeksiyöz ajanların varlığını değerlendirmek (örn., malarya, Borrelia)
  • Lenfoproliferatif bozuklukları sınıflamak (enfeksiyöz veya malign)

 Veriler Physician review of the Peripheral Blood Smear: When and Why. Laboratory Hematology 2001; 7: 175-179.alınmıştır.

 

Periferik yayma gözden geçirilmesi ve yapılması gereken durumlar ve/veya bulgular Tablo 26’de listelenmiştir. Mutlak görüş birliğine başlangıçta sadece blastların varlığı konusunda varılmışsa da, en sonunda, analizörler tarafından saptanmayan veya normal sayısal sonuçlar ile maskelenen durumların belirlenmesinde periferik yayma gözden geçirmesinin gerekli olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Otomatik analizör sonuçları Tablo 26’de gösterilen bulguların herhangi biri için işaretlere sahip bir hastada ciddi bir hastalık olabilir. Aynı durum teknisyenin periferik yayma gözden geçirmesinin Tablo 25’de listelenen bulgulardan herhangi biri vermesi için de geçerlidir ve bu hastalıklardan bazıları potansiyel olarak yaşamı çok yakın zamanda tehdit edebilir. Dolayısıyla, periferik yayma gözden geçirmesi tıbbi yönden uygundur çünkü hem klinik bakımının hem de laboratuar çalışmalarının kalitesini artırır. periferik yayma gözden geçirmesi tıbbi yönden endikedir çünkü hastanın tıbbi bakımını iyileştirebilir.

 

Tablo 26. Periferik Yayma Gözden Geçirmesinin Tıbbi Açıdan Endike Olabildiği Bulgular/Durumlar

 

 

İlk gözlem veya olay

 

Anormal hücreler

 

 

Anormal eritrosit indeksleri   /morfolojisi

 

 

 

 

Kan yaymasında görülebilen  mikroorganizmalar için klinik veya diğer kuşku

 

Herhangi bir dizide displastik hücreler

 

Eritrositlerde veya trombositlerde inklüzyonlar

 

Lökositlerde intranükleer ve/veya intrasitoplazmik inklüzyonlar

 

Pansitopeni veya belirgin sitopeni

 

Bulgu veya durumun örnekleri

 

Blast; anormal lenfoid hücreler, lenfositoz, diğer önceden belirlenmiş kriterler (örn., olgunlaşmamış hücreler)

 

Önemli ölçüde azalmış/artmış MCV;

ayaktan tedavi edilen hastada artmış RDW;

nRBC;

rulo, şistositler, sferositler, gözyaşı damlası RBC’ler

 

Malaria, Babesia, Borrelia, C. Perfiringes, ehrlichiosis

 

 

 

Pelger-Huet anomalisi; dev trombositler

 

Hemoglobin C veya diğer kristaller; Howell-Jolly cisimcikleri

 

 

Auer çubuğu, Chediak-Higashi sendromu, HIV veya diğer sistemik enfeksiyon; May-Hegglin anomalisi

 

Gri trombosit sendromu; paroksizmal noktürnal hemoglobinüri

 

 

Sonraki gözlem veya olay

  Bilinen bir hematolojik malinite/kök hücre hastalığı için tedavi edilen bir hastada anormal hücrelerin sürekli varlığı

 

Tedavi altındaki bir hastada enfeksiyöz organizmaların varlığı

 

 

Rezidüel akut lösemi

 

 

 

 

 

Parazitemi düzeyini belgeleme

Burada sunulan durumlar ve bulgular tüm durum/bulguları kapsamamaktadır. Spesifik klinik uygulama ve/veya test merkezi periferik yayma gözden geçirmesi için uygun tıbbi endikasyonları belirleyecektir.

Veriler Physician review of the Peripheral Blood Smear: When and Why. Laboratory Hematology 2001; 7: 175-179’den alınmıştır.

 

 

3.5.9. Periferik Yaymaların Hazırlanması

 

Periferik yaymanın incelenmesi hematolojik değerlendirmenin bir parçasıdır. Elde edilen bilginin güvenilirliği iyi hazırlanmış ve iyi boyanmış yaymalara bağlıdır. Morfolojik değişiklikler ısıya, zamana ve depolamaya bağlı olarak önemli olabildiğinden periferik yayma mümkün olduğunca hemen hazırlanmalıdır. En iyi sonuçlar 2 saat içinde elde edilmektedir. Periferik yaymalar venöz(antikoagüle kan) ve kapiller yoldan alınan kan örneği ile yapılabilir. Antikoagülan olarak K2EDTA  veya K3EDTA, sodyum sitrat ve ACD gibi antikoagülanlar kullanılabilir(230). Heparin genellikle trombositlerin morfolojik yorumlanmasını interefere eder ve kümeleşmeye neden olduğu için tercih edilmez. . Kan yaymaları otomatik hematolojik analizden kalan antikoagüle edilmiş kan örneklerinden de hazırlanabilir. Ancak antikoagülan nedeniyle hücre görünümü ve boyanmasında artefaktlar olabilir. Optimal morfoloji ve boyanma; pıhtılaşmamış kandan ve çoğunlukla da parmak delme prosedüründen elde edilen kandan sağlanır. Hücrelerin  lam veya lamel boyunca mekanik olarak yayılması da hücreleri bozar, ancak bu artefakt doğru teknik ile en aza indirilebilir. Periferik yaymanın hazırlanmasında üç yöntem vardır:

a. Manuel yöntem (lam  ve lamel)

b.Yarı otomatik yöntem (lam, santrifüj )

            c.Otomatik yöntem(lam)

NCCLS(213) periferik kan filmlerinin hazırlanmasında referans yöntem olarak lam (kama) tekniğinin kulllanılması gerektiğini düşünmektedir. Alt komite çalışmaları ile lam yönteminin kabul edilebilirliği de doğrulandı.

 

3.5.9.1. Manuel Yöntem

3.5.9.1.1. Lam Yöntemi (Referans Metot)

 

Kan yaymaları lam yöntemi ile temiz cam lamlar üzerinde de hazırlanabilir. Bu yöntemde 30µL kan lamın yaklaşık olarak ortasına, ucun 1-2 cm gerisine koyulur. İkinci yayıcı lam 30-45 derece açıyla yerleştirilir ve kan damlasıyla temas etmesi için geri itilir. Kan damlası lamın kenarına doğru yayılır; kanın iki lam arasında yayılması ile yayma oluşturulur. Yayıcı lam kan orta incelikte yayma oluşturuncaya kadar orta hızda ileri doğru itilir. Bu teknik 3-4 cm uzunluğunda bir yayma oluşturur. Yayıcı lamın kenarları düzensiz ise veya yayıcı lamın hızı nedeniyle artefakt oluşabilir. Cam lam preparatları filmin kenarlarında daha büyük beyaz hücrelerin birikmesi insidansını artırmış ve hücre dağılım hatalarına yol açmıştır. Yayıcı lamın hızlı hareketi hücre popülasyonunun daha homojen dağılımını sağlar. Yayıcı lam temiz, kuru ve ilk lamdan biraz daha dar olmalıdır; böylece kenarlar mikroskop altında kolayca incelenebilir(41). Lamlar elde sallanarak veya elektrikli kurutucuya tutularak hızla kurutulmalıdır. Yaymanın  kalınlığı yayıcı lamın açısı veya yayma hızı değiştirilerek ya da daha küçük veya daha büyük kan damlası kullanılarak ayarlanabilir. Belirli bir açıda yayıcı lamın itilme hızının arttırılması da yaymanın kalınlığını arttırır. Yayma  lamın tüm yüzeyini kaplamamalıdır. İyi bir yaymada kalın bir kısım, ince bir kısım ve birinden diğerine dereceli geçiş vardır. Yayma  düz, homojen bir görünüm sergilemeli, kırışıklık, çıkıntı veya delik olmamalıdır. Yayıcının kenarı kesinlikle düz olmalıdır. Pürüzlü ise yaymada lökositlerin uçlarında tırtık görülür.

Optimal kalınlıktaki yaymalarda yaymanın büyük kısmında eritrositlerde kümeleşme görülür ancak ince uca doğru eritrosit eşit dağılımı ve daha ince yayılması söz konusudur. Yayma  ortam havasında ne kadar hızlı kurursa, her bir hücre lam üzerinde o kadar iyi yayılır. Yavaş kurutma (örn, nemli havada) hücrelerde kontraksiyon artefaktlarına neden olabilir. Lamın buzlu tarafına veya periferik yaymanın kalın ucuna kurşun kalem ile kimlik bilgileri yazılır. Bu metot  laboratuarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır(230).

3.5.9.1.2. Lamel Yöntemi

 

Lamel yaymaları toz, pamuk lifi ve yağ içermeyen lameller (no.1, ½ inç kare veya 20 x 22 mm) kullanılarak hazırlanır. Bu tip lameller kanın yüzey boyunca optimal yayılmasını ve minimal artefakt sağlar. Genellikle yüksek kaliteli lameller ek temizlik gerektirmez ancak eskimeyle bozulma görülebilir. Plastik ıslatılamayan lameller bu preparatlar için iyi değildir. Yayma lamelin baş parmak ve işaret parmağı arasında iki komşu köşeden tutulmasıyla hazırlanır. Taze veya antikoagüle edilmiş kanın küçük bir damlası lamelin ortasına koyulur. Damla çok büyükse kalın yayma elde edilir. Damla çok küçükse çok ince yayma elde edilir. Daha sonra ikinci bir lamel aynı şekilde diğer elle tutulur ve ilk lamelin üzerine koyulur ve düzgün, hızlı hareketle yavaşça 45 derece açıyla döndürülür. Ardından, iki lamel birbirinden uzağa itilir. Yayılma durduğu anda lamelleri hızla ancak sertçe yüzeylere paralel düzlemde birbirinden ayırılır. Genellikle kan bir lamelde diğerine göre çok daha homojen yayılır. Lameller yayma tarafı yukarı gelecek şekilde temiz bir kağıda koyulur ve ortam havasında kurumaya bırakılır veya mukavva kutudaki bölümlere arka arkaya yerleştirilir(41).

Venöz kandan yapılan yaymalar lamel üzerinde bir damla kan ile benzer şekilde hazırlanır  ve tarif edilen şekilde prosedür uygulanır.  Bu yöntemin enfeksiyon riski lam yöntemine göre yüksektir ve artık kullanılmamaktadır(230).

 

3.5.9.2. Yarı Otomatik Yöntem

3.5.9.2.1.  Santrifüj(Spinner) Yöntemi

 

Periferik yayma hazırlamasında hücrelerin homojen dağılımını yapan otomatik teknikler de geliştirilmiştir. Bu işlemlerde iki tip cihaz kullanılır: santrifüjleme yapan cihazlar ve mekanik olarak kanı yayan cihazlar. Santrifüjleme teknikleri; beyin-omurilik sıvısı gibi sıvılardaki hücrelerin yaymaları hazırlanırken az sayıda hücrenin küçük bir bölgede yoğunlaştırılması gerektiği zaman yararlıdır.  Mekanik yayıcılar manuel tekniği taklit eder ve çok sayıda kan yayması hazırlanırken yararlıdır. Genelde, otomatik tekniklerle hazırlanan yaymalar deneyimli teknisyenin yaymalarına göre daha düşük kalitededir. Bu yöntemin avantajı  homojen bir kan yayma oluşturularak tüm hücreler tek bir tabaka halinde ayrılır ve rastgele dağılır ve lökositler  yaymadaki herhangi bir noktada kolayca görülebilir. Lam yaymalarında  ince kenarın ucunda orantısız monositler, ince sivri ucun hemen gerisinde ve yaymanın yan kenarlarında nötrofiller bulunur. Bu yöntem uygulamada çok kullanılmaz(230-231).

 

3.5.9.3. Otomatik Yöntemlerle Periferik Yayma Yapılması

 

Periferik yayma hematoloji alanında periferik kanın incelenmesinde önemli bir alandır. Periferik yayma işlemi lökosit alt tiplerinin, anormal lökositlerin tanımlanmasını, eritrosit ve trombositlerin incelenmesini içerir. Kan sayım analizörlerinin birçoğu isteğe bağlı olarak otomatik periferik yayma ve boyama yapabilmektedir. Otomatik  periferik yayma(slide maker) ve boyama yapan(slide stainer) sistemler birçok kan sayım cihazına opsiyonel olarak entegre edilebilir. Otomatik slide maker ve stainer sistemlerinin kan sayım cihazlarına entegrasyonuyla periferik yayma işlemlerinin standardizasyonu ve otomasyonu böylece sağlanmış oldu. Bu özellik ile klinik laboratuarlarda  periferik yayma işlemlerinde manuel işlem (yayma ve boyama) basamakları otomatikleşmiş oldu(17,54,171, 232). Beckman Coulter Sistemleri(Coulter GenS, LH 755), Sysmex XE 2100, ABBOTT CellDyn 4000, ABX PENTRA DX 120 ve ADVİA 120’ gibi kan sayım cihazlarına periferik yayma(slide maker) ve lam boyama(slide stainer) modülleri entegre olabilir.Otomatik yayma ve boyama sistemlerinin özellikleri aşağıda kısaca özetlenmiştir.

 

3.5.9.3.1. Otomatik Periferik Yayma Sistemi

                   (Slide Maker)

            Otomatik periferik yayma sistemi(Slide Maker) periferik yayma işlemlerinde standartizasyon getirmekte ve yayma kalitesini arttrmaktadır. Slide maker modülü kan sayım sistemlerinden almış olduğu kan örneğini kullanarak online olarak hızlı ve kolay bir şekilde periferik yayma hazırlamaktadır. Her bir yayma tarih, zaman ve  örnek bilgilerinin bulunduğu barkodlu veya barkodsuz etiket ile tanımlanmaktadır. Bu sistemlerin  yararlı özellikleri aşağıda sunulmuştur(233-234).

  • Kan sayım cihazlarında CBC+Diff+Retikülosit+yayma çalışması tek bir tam kan aspirasyonuyla yapılmaktadır. Yayma işlemi için ayrıca kan gerektirmemektedir.
  • Bu cihaz rutin bakım gerektirmemektedir.
  • Slide maker cihazının kullandığı yayma hazırlama işlemi NCCLS standartlarının tümünü karşılayarak manuel işlemleri azaltmaktadır.
  • Kan örneğinin değişen viskositesine göre yayma otomatik olarak ayarlanabilmektedir.
  • Yüksek kalitede yayma hazırlanmaktadır.

 

3.5.9.3.2. Otomatik Lam Boyama Sistemi

             ( Slide Stainer)

 

Otomatik lam boyama sistemi kan sayım sistemlerini tamamlayıcı opsiyonel bir cihazdır. Slide Stainer modülü kan sayım cihazlarına entegre olduğundan slide maker cihazının hazırlamış olduğu yaymaların boyama işlemini tam otomatik online olarak yapmakta ve mikrospik incelemeye hazır duruma getirmektedir(233-234).

  • Bu sistemler ayrıca elde manuel olarak hazırlanan yaymalarının da( periferik, kemik iliği gibi) boyanabilmesini sağlar. Boyma işleminin sırası ve süresi kullanıcı tarafından proglanabilir.
  • Acil çalışmalar öncelikli yapılabilir.
  • Yayma kururutucusu cihazın üzerinde bulunduğundan  standartizasyon artar.
  • Bu cihazlar Wright, Wright-Giemsa, May Grünwald gibi kullanıcının kendisinin oluşturucağı protokoller ile boyama olanağı sağlar.

 

3.5.10. Periferik Yaymada Kullanılan Boyalar

3.5.10. 1. Referans Boya

 

Periferik yayma çalışmalarında kullanılan anilin boyalar; metilen mavisi gibi bazik boyalar ve eozin gibi asit boyalar olmak üzere iki genel sınıfa ayrılır. Çekirdekler ve kanın diğer belirli yapıları bazik boyalar ile boyanır; dolayısıyla bunlar bazofiliktir. Sadece asit boyalar ile boyanan yapılara asidofilik veya eozinofilik yapılar adı verilir. Bu ikisinin kombinasyonuyla boyanan diğer yapılara nötrofilikler adı verilir(235).

Polikrom metilen mavisi ve eozin boyaları orijinal, zaman alan Romanowsky yönteminin geliştirilmiş halidir ve yaygın biçimde kullanılır. Bunlar kandaki normal ve anormal yapıların çoğunu ayırıcı biçimde boyarlar.  ICSH, Romanowsky boyamasını referans yöntem olarak kabul etmektedir(119). Romanowsky boyası metilen mavisi ve/veya onun oksidasyon ürünlerini (azur B) içeren herhangi bir boya ve halojenli floresan boyadır (genellikle eozin B veya Y). Metilen mavisi(tetrametiltiyonin) tiazinin temel bileşenleri ve onun oksidatif demetilasyon ile oluşan analoglarının değişken oranlarını içerir: Bunlar azur B (trimetiltiyonin), azur A (asimetrik dimetil tiyonin), simetrik dimetiltiyonin ve azur C (monometiltiyonin)dir. Asidik bileşen eozin ksanten iskeletinden elde edilir.

Referans alt tip sayım preparatları Romanowsky boyası ile boyanmayı gerektirir. Hücre unsurlarının optimal boyanması hem olgun hem de olgunlaşmamış lökositlerin ve ayrıca anormal hücrelerin doğru tanımlanmasına yardımcı olur. Başarılı boyalar :

·       Romanowsky etkisini tutarlı olarak yaratır; bu, önceden belirtilen boyaların kombine etkisiyle uygun pH’da (6.4- 7.0) belirli hücre bileşenlerini tipik olarak boyar. Bu hücre bileşenleri lökosit çekirdekleri ve nötrofile spesifik granülleri içerir.

·       Başarılı boyalar diğer hücre bileşenlerine  karakteristik renkleri (tipik olarak maviler ve pembeler) kazandırır:

·       Lökosit iyi korunmuş olmalıdır ve aşırı vakuolleşme veya çekirdek şeklinde değişiklikler gibi antikoagülan etkileri minimal olmalıdır.

·       Bazı lenfoproliferatif bozukluklar dışında lökositlerin %2’den azı bulaşmış olabilir. Granülositik, monositik, lenfositik ve diğer hücrelerde tekrarlanabilir boyama olmalı ve çekirdek-sitoplazma ayrımı belirgin, çekirdek kromatin paternleri ayrı ve sitoplazmik renk farkları belirgin olmalıdır(210).

 Romanowsky boyalarının çoğu metil alkolde çözdürülür ve fiksasyon ile boyamayı birleştirir. En iyi bilinenler arasında Giemsa ve Wright boyaları yer alır.

 

Wright Boyası: Bu boya eozin ve tiazinlerin kompleks bir karışımını; genellikle  %50-75 metilen mavisi ve azur B (diğer türevler  %10-25) içeren metil alkolik bir solüsyondur(244). Biyolojik Boyalar Komisyonu tarafından tescillenen Wright boyası kullanıma hazır solüsyon veya toz olarak piyasada bulunur. Wright boyasıyla iyi boyanan yaymalar çıplak gözle bakıldığında pembe renktedir. İncelendiğinde hücreler eşit dağılmış görünmelidir.

  • Eritrositler limon sarısı veya kırmızı değil, pembe olmalıdır. Minimum çökelti olmalıdır. Kan hücreleri vakuol gibi artefaktlar içermemelidir.
  • Lökositlerin çekirdekleri mordur, kromatin ve parakromatin kolayca ayırt edilir ve sitoplazmik nötrofilik granüller ten rengidir.
  • Eozinofilik granüller kırmızı-turuncu renktedir ve her biri ayrı ayrı görülebilir. Bazofil koyu mor granüllere sahiptir.
  • Trombositler koyu lila granüllere sahiptir. Varsa bakteriler mavi görünür.
  • Lenfositlerin sitoplazması genelde açık mavidir; monositlerinki ise açık mavi-gri renktedir. Malarya parazitleri gök mavisi renkte sitoplazma ve kırmızı-mor kromatine sahiptir.

Wright boyası sölüsyonu: 3 gram toz Wright Boyası 100 ml absolü metanolde çözülür. İyice kapatılarak oda ısısında 24 saat bekletilir. Süzülerek kullanılır(236).

Sörensen’s tampon solüsyonu hazırlamak için(pH 6.4);  primer (monobazik) potasyum fosfat (KH2PO4) anhidr 6.63 g; sekonder (dibazik) sodyum fosfat (Na2HPO4), anhidr 2.56 gram tartılarak distile suyla bir litreye tamamlanır. Daha alkali bir solüsyon (pH 6.7) 5.13 g potasyum tuzu ve 4.12 sodyum tuzu kullanılarak hazırlanabilir.

Metot:

1.Yaymalar metonol ile fikse edilir.

2. Yaymalar yan eğitilerek metanol uzaklaştırılır.

3. Yatay pozisyondaki lamın üzerine boya dökülür ve 2 dakika beklenir.

4.Çalışılan lamın üzerindeki boya yatay lamdan uzaklaştırılmadan eşit miktarda tampon solüsyon dikkatle eklenir ve yavaşça üflenerek karıştırılır.

5. 3 dakika beklenir.

6. Lam distile suyla 30 saniye yıkanır.

7. Yatay pozisyonda lam kurutulur. Kurutma kağıdı ile kurutma yapılmamalıdır.

8. Gerekirse  üzeri kapatılır.

Ayrıca  Maile, J.B.in 1967’nin önerdiği boya karışımı da hazırlanabilir. Bu boya karışı T Yüksek İhtisas Hastanesi Hematoloji Laboratuvarında kullanılmaktadır. Bu boya karışımı için  9 gram toz Wright boyası, 1.0 gram toz Giemsa boyası, 90 ml Gliserin  2910 ml anhidr ve asetonsuz Metanolde çözülür. Kahverengi bir şişeye konulur ve sıkıca kapatılarak kullanılır. Gerekirse çalışma sırasında süzülebilir(ayrıntılı bilgi Yüksek İhtisasHastanesin’den alınabilir).

 

Diğer Boyalar: Bu boyalarGiemsa, Leishman, May-Grünwald, MacNeal boyalarıdır. Ayrıca Wright-Giemsa, May-Grünwald-Giemsa gibi birçok boyanın çeşitli kombinasyonları da bulunmaktadır. Bazıları belirli amaçlar için özellikle önerilmektedir; örneğin, Giemsa boyası malarya parazitleri ve protozoaların boyanması için mükemmeldir(237).

 

3.5.10.2. Periferik Yaymaların Rutin Boyanması

 

Kan yaymaları genellikle Wright veya May-Grünwald-Giemsa boyaları ile boyanır. Her iki boya Romanowsky prosedürlerinin modifikasyonlarıdır. Bazik boya metilen mavisi ve eozinden formüle edilir. Wright boya formülasyonu metilen mavisini hücreyi boyayan metilen azüre dönüştürmek için sodyum bikarbonat kullanır. Giemsa boyaları dönüşmüş azur bileşiklerini elde etmek için bilinen miktarlarda asit bikromat kullanır. Tüm Romanowsky boya tipleri suda çözünmez niteliktedir ancak metil alkolde çözünürler. Boya su içermemelidir; su kırmızı kan hücre artefaktlarına yol açar. Su artefaktları lamların veya lamellerin boyamadan önce anhidr metanol içerisinde fikse edilmesiyle önlenebilir.

Optimal boyama koşulları her yeni boya serisinden önce belirlenmelidir. Metilen mavisinin azur bileşiklerine dönüşümü boya şişedeyken devam eder; dolayısıyla boyama koşulları zaman içerisinde değişebilir. Metil azurler bazik boyalardır ve hücrenin asidik yapılarına (nükleik asitler ve proteinler) bağlandıklarında leylak-mavi renk verirler. Eozin hücrenin bazik yapılarıyla etkileşir ve sitoplazma bileşenlerine ve hemoglobine kırmızımsı ton verir. Doğru boyanan  lam pembe tonludur. Eritrositler turuncu-pembe renge ve lökositler morumsu-mavi çekirdeklere sahip olmalıdır. Romanowsky boyaları lökosit granüllerini ayırıcı biçimde boyarlar ve hücrelerin morfolojik analizine yardımcı olur. Dolayısıyla nötrofil granülleri hafifçe baziktir ve azurofilik bileşen ile zayıf boyanır. Eozinofiller güçlü bazik bir spermin türevi içerir ve eozin ile boyanırlar. Buna karşılık bazofil granüller ağırlıklı olarak asidik proteinler içerir ve koyu mavi-leylak renkte boyanırlar. Hücrelerin üzerinde çökelti olmamalıdır çünkü bu lamların veya lamellerin iyi temizlenmediğini gösterir. Lamların üzerinde toz da artefakta neden olur. Boya solüsyonları çok fazla kullanıldıkları zaman süzülmeli veya haftada bir kez değiştirilmelidir.

Aşırı Mavi Boyanma. Bazen hücrelerde aşırı mavi renklenme görülür. Bu, çok uzun boyama sürelerinden, eskimiş ya da yanlış hazırlanmış tamponun çok alkali hale gelmesinden, eski kan yaymalarından, çok kalın kan yaymalardan  veya boya ya da seyrelticinin alkalitesinin çok yüksek olmasından kaynaklanır. Bu tip yaymalarda eritrositler mavi veya yeşil görünür, nükleer kromatin koyu mavi-siyah ve nötrofillerin granülleri derinlemesine boyanmış ve büyük ve çarpıcı görünür. Eozinofillerin granülleri mavi veya gridir. Daha kısa süreli boyama veya daha az boya ve daha çok seyreltici kullanımı ile problemi düzeltilebilir. Bu basamaklar etkisiz kalırsa, tampon çok alkali olabilir ve pH’ı daha düşük yeni bir tampon hazırlanmalıdır.   Boyamanın kalitesi distile su ile hızla ve yoğun durulama ile artırılabilir. Lamda hücreler arasındaki bölgeler boyanırsa, bu genellikle lamın yetersiz yıkandığını, heparin antikoagülasyonunu veya muhtemel paraproteinemiyi gösterir.Kalın yaymalar, uzun boyama süresi, yetersiz yıkama veya boya ya da seyrelticinin alkalitesinin çok yüksek olması aşırı bazofiliye neden olabilir.

Aşırı Pembe Boyanma Boyama çok pembe veya kırmızı görünürse, genellikle problem çok asidik tampondur. Bu, soluk boyanmış lökosit çekirdeklerine, çok fazla turuncu-kırmızı kan hücrelerine ve parlak kırmızı eozinofil granüllerine yol açar. Aşırı kırmızı rengin diğer nedenleri yetersiz boyama süreleri ve lamın aşırı yıkanması, lamellerin kurumadan önce koyulması veya boya ya da tamponun asiditesinin çok yüksek olmasından kaynaklanır. Çoğunlukla, boyama problemleri solüsyonların pH’ındaki problemlerden kaynaklanır ve yeni tamponlar sorunu giderir. Bu tip yaymalarda eritrositler parlak kırmızı veya turuncu, nükleer kromatin açık mavi ve eozinofillerin granülleri parlak kırmızı renktedir. Asidite artışının nedenlerinden biri boya veya tamponun asit gazlarına maruz kalmasıdır. Problem tamponun düşük pH’ı veya metil alkol olabilir; metil alkol bekleme sırasında oksidasyon sonucunda formik asit geliştirmeye eğilimlidir(236).

Diğer Boyama Problemleri. Yetersiz boyanmış eritrositler, çekirdekler veya eozinofilik granüller olması gerekenden az boyama veya aşırı yıkamaya bağlı olabilir. Boyama süresinin uzatılması veya yıkamanın azaltılması bu sorunu ortadan kaldırabilir. Yayma  üzerinde çökelti, temiz olmayan lamlar, boyama süresince kuruma, lamın boyama döneminin sonunda yetersiz yıkanması ve özellikle de ilk yıkama sırasında lamın yatay şekilde tutulması, boyanın yetersiz filtrasyonu veya tozun lam veya yaymanın üzerine çökmesinden kaynaklanabilir.

 

3.5.11. Periferik Yayma Yapılırken Dikkat Edilecek Noktalar

 

Periferik yayma hazırlama ve ve boyamaya ilişkin kılavuzlar pek çok laboratuar ve hematoloji ders kitaplarında bulunmaktadır ve yakın zamanlarda  gözden geçirilmiştir (213,). İyi hazırlanmış ve boyanmış bir periferik yayma  kan hücrelerinin kaliteli morfolojik analizi için şarttır. Türkiye’de  periferik yayma   hazırlama için en sık kullanılan yöntem Wright veya Wright-Giemsa boyamasıyla lam yöntemidir. May-Grünwald-Giemsa tipi boyama Avrupa’da ve diğer ülkelerde daha popülerdir. Hücrelerin yüksek kalitede tanımlanması için periferik yaymanın  morfolojik analize uygun bölgesinin kullanılması gerekir çünkü periferik yaymanın  bir kısmı kalın, bir kısmı ince olacaktır. Tüm hücrelerin temsili sayımı için, incelenen bölgenin tam genişliğini kapsamak gerekir çünkü lökositler cam yüzey üzerinde eşit dağılmazlar. Monositler ve nötrofiller gibi büyük hücreler periferik yaymanın ucuna (“ince uç”) ve yanlara doğru itilirler. Dolayısıyla periferik yaymanın   yan tarafları incelemeye dahil edilmediğinde hücre alt tipleri doğru şekilde sayılmayabilir. İzleme taraması bu tip problemleri önler ve aynı zamanda aynı hücrelerin tekrar  analizini önler.

Periferik yaymayla analiz edilen hücrelerinin tüm tipleri için aşağıdakilerin geçerli olduğunu bilmek önemlidir.

·       Hücrelerin lama uygulanma işlemi (yayma, smear, döndürme) hücrelerin görünüm ve dağılımlarında değişikliğe yol açabilir.

·       İkincisi, hücreler havayla temas ederek kuruduklarında orijinal küremsi görünümlerini kaybedip düzleşirler.

·       Son olarak, hücrelerin içerikleri fiksasyon ve ardından boyama nedeniyle değişikliğe uğrarlar. Dolayısıyla fikse edilip boyanmış kan hücrelerinin morfolojik analizleri çok sayıda artefakt içerir ve süspansiyon içerisindeki işlemden geçirilmemiş canlı hücreler ile doğrudan karşılaştırma herzaman mümkün olmayabilir veya çok iyi olmaz. Tipik bir örnek kronik lenfositik lösemili hastaların kırılgan lenfositlerinde görülür; bunlar kan hücrelerinin lamlara uygulanmasında kullanılan yöntemler ile genellikle tanınamayacak kadar hasar görürler.

Optimal sonuçlar periferik yayma hemen hazırlanıp tamamıyle kurutulduktan sonra hemen fikse edilerek boyanmasıyla elde edilir. Boyamadan önce periferik yaymanın fikse edilmesi önerilmektedir(236). Birçok laboratuar  periferik yayma kurutuldıktan sonra pratik olduğu için hemen boyama yapmaktadır. Bu prosedür genellikle kabul edilebilir . Ançak  periferik yaymalar hemen boyanmazsa, metanol ile fiksasyon 4 saat içinde yapılmalıdır. Laboratuarlarda genellikle lamlar kuruduktan sonra bir saat sonrası tercih edilir. Aksi halde yaymada  arka plan gri/mavi renk olacaktır. Boyama ve fiksasyon solusyonları morfolojik artefaktları önlemek için su içermemelidir(%3). Manuel boyanma işleminde kullanılan lamlar coplin kavanozlar içine daldırılmalıdır. Lamların düz bir zeminde boya solusyonu ile kaplanması yöntemi; buharlaşmadan dolayı çökelti oluştuğu için bu yöntem tercih edilmemelidir. Sıcak havalarda boyama işlemi sırasında buharlaşmayı önlemek için mutlaka kapalı kavanoz ve petri kutusu tercih edilmelidir. Otomatik boyama cihazları spesifik boyama prosedürleri gerektirir ve kullanıcılar gereksinimlerine ve  hücre boyanmasına göre değişik modifikasyonlar yapabilir.

Boyama protokolleri laboratuarlar arasında oldukça değişkendir. Boyama ve boyama sonuçları için izlenecek yollar hematoloji  kitaplarında bulunabilir. ICSH  periferik yaymalar için referans boyama metodu için saf eosin Y ve azure B içeren solusyonları önermektedir. Periferik yaymaların kalitesi için genel kural boyama işlemininin kan yaymlarındaki bütün hücre tiplerini tanımlayacak şekilde olmasıdır. Bu hem manuel hemde otomatik yöntemler için geçerlidir. Periferik yaymalar tipik olarak romanowsky boyalarla boyanır ve bu boyalar değişk oranlarda thiazin ve eozin içermektedir. Değişik metodlar tanımlanmıştır. Wright, Wright-Giemsa, May-Grünwald-Giemsa ve Leishman boyası gibi. Boya ve fiksasyon için kullanılan malzemeler oda ısında ağzı sıkıca kapalı şekilde muhafaza edilmelidir. Romanowsky boyalar soğukta bozulabilir. Romanowsky boyalar karsinojenktir, deri ve mukoza ile temasdan kaçınılmalıdır. Romanowsky boyalarla boyanmış hücrelerin inefektif olduğu varsayılmaktadır. Genellikle tam boyanmış periferik lamların zararlı etkisi yoktur. Ançak metanol ile fiksasyon işlemi HIV , hepatit B ye karşı ve prionların neden olduğu diğer enfeksiyon tiplerine koruyuculuk sağlamamaktadır. Romanowsky boyalar, methanol, alkol, aseton, ksilol, toluen gibi maddeler oldukça yanıcıdır güvenli kabinlerde saklanması gereklidir. Lamlar uzun süre saklanacaksa ışıktan uzak tutulmalıdır(236).

 

 

 

3.5.12. Periferik Yayma’nın Değerlendirilmesi

3.5.12.1. Kan Hücrelerinin Morfolojik Analizi

 

İyi hazırlanmış bir kan yaymasının dikkatle incelenmesi hematolojik hastalık değerlendirmesinin önemli bir parçasıdır. Otomatik hematoloji analizöründen elde edilen veriler ile spesifik tanı koyulsa da, pek çok hastalıkta kan sayıları normal ancak hücre morfolojisi anormaldir. Periferik kan yayma incelemelerinde görülebilen ve spesifik hastalık durumları ile ilişkili olan eritrositlerin anormal örnekleri Tablo 27’de yer almaktadır(Şekil 35). Ancak morfolojik analiz kötü hazırlanan veya kötü boyanmış kan yaymaları nedeniyle büyük ölçüde aksayabilir. Tatmin edici kan yaymalarının hazırlanması kan yaymasının hazırlanması ve boyama tekniklerine özellikle dikkat edilmesini ve normal ve patolojik hücre tiplerinin morfolojik görünümleri Şekil 49’da detaylı olarak gösterilmiştir(235, 238).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

D

B

A

A. Normal Eritrosit

 

C

B. Mikro/Hipokrom

C. Makro

D. Target

E. Sferosit

 

H

G

E

F. Heinz Cisimcikleri

 

F

G. Şiştozit

H. Çekidekli Eritrositler

I. Polikormazi

J. Gözyaşı Hücresi

 

 

       
 

I

 

J

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 49. Periferik Yaymanın Normal, Renk Değerlendirilmesi İnklüzyon Cisimcikleri ve Pokilisitoz Yapan Durumlar

 

Periferik  yayma üzerinde eritrositlerin kantitatif anormalliklerini değerlendirmek zordur; ancak eritrositler büyüklük, şekil ve hemoglobin dağılımındaki değişiklikler ve hücre inklüzyonlarının varlığı açısından değerlendirilmelidir(Tablo 27). Periferik yaymada eritrositmorfolojisi incelenirken; normal ve anormal bulgular not edilir.

Normal bulgular:

         a.   Normositik: normal hücre büyüklüğü ve şekline göre(Şekil 34/A)

a.      Normokromik: normal hemoglobin içeriği ve rengine göre

 Anormal Bulgular:

a.      Spesifik terimlere göre

b.     Anormalliklerin ayırt edilme derecesine göre not edilmelidir.

 (Hafif(+): 1-5 hücre/10 alanda, Orta(++): 6-15 hücre/ 10 alanda,  Belirgin(+++): > 15 hücre/ 10 alanda)

Eritrositler  genellikle yayma boyunca eşit dağılmazlar(239). Optimal eritrosit morfolojisi, eritrositlerin birbirine yakın olduğu ancak örtüşmediği yayma bölgesinde görülür. Eritrositlerin çok ince veya kalın yayıldığı bölgelerde artefaktlar artar. Bazı kan yaymalarında eritrositler birbirine yapışık görünür ve eritrosit kümeleri oluşur; buna rulolar adı verilir. Bu bulgu eritrositlerin birbirine çok yakın olduğu yayma bölgelerinde normal hastalarda da görülebilir. Ancak ruloların yaymanın daha ince bölgelerinde de görülmesi eritrositi kaplayan ve eritrositler arasında normal elektrostatik itme kaybına bağlı aglütinasyona neden olan paraproteinin varlığını gösterir. Eritrositler  büyüklük ve şekil bakımından aynı olmalıdır ve ortalama çapları 7.2 -7.9 mikrometredir. Bu, bir mikrometre kullanılarak ya da daha küçük bir lenfositin (aynı büyüklükte veya biraz daha küçük) çapıyla karşılaştırılarak değerlendirilebilir. Eritrosit  büyüklüğündeki farklılığa anizositoz adı verilir. 9 mikrometreden büyük ve iyi hemoglobinlenmiş hücrelere makrositler adı verilir. Daha az olgunlaşmış eritrositler makrositiktir ve hemoglobinlerinde mavimsi ton vardır (polikromatofili) veya RNA kalıntısı ve ribozomlara bağlı olarak hücrede ince bazofilik noktalar bulunur. Mikrositler çapları 6 mikrometreden küçük hücrelerdir. Normal eritroid hücreler yuvarlaktır(Şekil 35/A). Eritrosit  büyüklüğünde değişikliklere poikilositoz adı verilir.  Eritrosit   ortasında soluk bir bölge olmalı ve turuncu-kırmızı hemoglobin halkası bulunmalıdır. Hipokromi kötü hemoglobinlenmeyi yansıtır ve çok ince hemoglobin halkası veya merkezi soluklukta artış oluşturur. Anormal hemoglobin dağılımı merkezinde hemoglobin noktası ve etrafında soluk bölge olan bir hücre oluşumuna yol açar (hedef hücresi). Anormal hemoglobinler kristaller de oluşturur. Sferositler ve makrositlerde ortadaki soluk bölge yoktur çünkü hücrenin kalınlığı artmıştır. Eritrositler  inklüzyonlar da içerebilir; örneğin, çekirdek materyali kalıntıları (Howell-Jolly cisimcikleri), mitokondri veya siderozomların kalıntıları (Pappenheimer cisimcikleri) veya enfeksiyöz ajanlar (malarya parazitleri)(240).  Periferik yaymada patolojik eritrositlerle ilgili detaylar Tablo 27’de gösterilmektedir.

 

Tablo 27. Kan Yaymalarındaki Patolojik Eritrositler

 

Kırmızı Hücre Tipi

Tarif

Altta Yatan Değişiklik

Hastalık Durumu İlişkisi

 

Akantosit (mahmuz hücresi)

Düzensiz spiküllü eritrositler; ortası yoğun, değişken uzunlukta çıkıntılar vardır

Hücre membran lipidlerinde değişiklik

Abetalipoproteinemi, parenkimal karaciğer hastalığı, splenektomi sonrası

 

Bazofilik noktalar

Noktalı bazofilik inklüzyonlar

Presipite ribozomlar (RNA)

Kaba noktalar: kurşun zehirlenmesi, talasemi.

İnce noktalar: çeşitli anemiler.

 

Bite hücresi (degmasit)

Bir kenardan içeriye düz yarım daire

Dalak ile Heinz cisimciği çukurluğu

Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz eksikliği, ilaç ile indüklenen oksidan hemoliz.

 

Burr hücresi (ekinosit) veya dikenli eritrosit

Kısa, eşit aralıklı spikülleri olan, iyi korunmuş ortası soluk eritrositler

Hücre membran lipidlerinde değişiklik ile ilişkili olabilir

Genellikle artefakta bağlıdır. Üremi, kanamalı ülserler ve gastrik karsinomda görülür.

 

Kabot halkaları

Dairesel, mavi, ipliğe benzer, noktalı inklüzyon

Nükleer kalıntı

Splenektomi sonrası, hemolitik anemi, megaloblastik anemi.

 

Ovalosit (eliptosit)

Elips şekilli hücre

Anormal hücre iskelet proteinleri

 

Kalıtsal eliptositoz

Howell-Jolly cisimcikleri

Küçük, ayrı, bazofilik, yoğun inklüzyonlar; genellikle tekli.

 

Nükleer kalıntı (DNA)

Splenektomi sonrası, hemolitik anemi, megaloblastik anemi.

Hipokromik eritrosit

Belirgin merkezi solukluk

Azalmış hemoglobin sentezi

Demir eksikliği anemisi, talasemi, sideroblastik anemi.

Leptosit

Düz, ince, hipokromik hücre

-

Obstrüktif karaciğer hastalığı, talasemi

 

Makrosit

Normalden büyük eritrositler (>8.5µ); Hb ile dolu.

Genç eritrositler, anormal eritrosit olgunlaşması.

Artmış eritropoez. Megaloblastik anemide oval makrositler.

Karaciğer hastalığında yuvarlak makrositler.

 

 

Mikrosit

Normalden küçük eritrositler (<7.0 µ )

 

-

Hipokromik eritrosit

Pappenhaimer cisimcikleri

Küçük, yoğun, bazofilik granüller

Demir içeren siderozom veya mitokondri artıkları

 

Sideroblastik anemi, splenektomi sonrası.

Polikromatofili

Genellikle makrositlerde gözlenen grimsi veya mavi renk.

 

Ribozom materyali.

Retikülositoz,eritrositlerin kemik iliğinden erken salınması.

Rulo

Eritrosit  kümeleşmeleri; bozuk para kümesini andırır

Dolaşımdaki paraprotein nedeniyle eritrosit kümeleşmesi

 

 

Paraproteinemi

Şistosit (miğfer hücresi)

Şekli bozulmuş, fragmanlı hücre, iki veya üç sivri uçlu.

Mikrodolaşımın fibrin lifleri nedeniyle mekanik olarak bozulması; kalp kapak protezi nedeniyle bozulma.

Mikroanjiyopatik hemolitik anemi (dissemine damar içi pıhtılaşma, trombotik trombositopenik purpura), kalp kapak protezi, ciddi yanıklar.

 

Orak hücre (drepanosit)

İki kutuplu, spiküllü formlar, orak şeklinde, her iki ucu sivri

 

HbS’nin moleküler agregasyonu

Orak hücre hastalıkları, S özelliği dahil değil.

Sferosit

Merkezi soluk olmayan, yoğun görünümlü küre şekilli hücre, genellikle çapı azalmıştır

 

Azalmış membran tekrarları

Kalıtsal sferositoz, immünohemolitik anemi.

Stomatosit

Ağız veya çanak benzeri deformite

Membran defekti ve anormal katyon geçirgenliği

 

Kalıtsal stomatositoz, immünohemolitik anemi.

Hedef hücre (kodosit)

Nişan tahtası benzeri görünüm; genellikle hipokromik

Hücre membranı tekrarlarında azalma

Karaciğer hastalığı, splenektomi sonrası, talasemi, hemoglobin hastalığı.

 

Göz yaşı hücresi (dakriyosit)

Bozulmuş şekilli, gözyaşı damlasına benzer hücre

-

Miyelofibrozis, miyeloptizik anemi.

 

Kjeldsberg C, ed. Hematolojik hastalıkların pratik tanısı, 3.baskı. Chicago: ASCP Press, 2000’den alınmıştır.

 

 

 

 

 

 

Daha sonra trombosit sayıları ve morfolojisi incelenir. Trombositler kırmızı-mor granüllü küçük mavi sitoplazmik fragmanlar şeklinde görülür. Trombositlerin çapı 1-2 mikrometredir ve şekilleri çok değişkendir. Trombosit sayıları yaymadan belirlenebilir. Normal trombosit sayımında yağ imersiyon bölgesi başına birkaç (5-15) trombosit olmalı veya 10-20 eritrosit başına yaklaşık 1 trombosit olmalıdır. Trombositlerin antikoagüle edilmemiş kan veya parmak delmeyle alınan kan kullanıldığında agregasyon oluşturabilecekleri ve bunun trombosit sayılarının düşük olduğu gibi hatalı bir izlenime yol açabileceği akılda tutulmalıdır.

Lökosit morfolojisi ve dağılımı en son analiz edilir. Lökositlerin sayısı yaymanın  orta büyütme objektif incelenmesiyle saptanır. Daha büyük hücrelerin anormal dağılımı kan yaymalarının özellikle kenarlarının incelenmesiyle dışlanmalıdır. Periferik yaymasının kenarlarındaki lökositler  artefakt tarzında daha küçük (hücre küçülmesi ve hücrenin kötü yayılımı nedeniyle) veya daha büyük (hücrelerin parçalanması nedeniyle) görünebilir. Yayma hazırlanırken dikkatli olunmalıdır çünkü hücreler, özellikle neoplastik hücreler mekanik basınçla çok fazla parçalanabilir. Lökositlerin optimal morfolojisi kan yaymalarının derhal hazırlanmasını gerektirir. Uzun saatler bekletilen kanda anlamlı artefaktlar görülmeye başlar ve sitoplazmik vakuolleşme, nükleer karyoreksi ve sitoplazma parçalanmasını içerir(210).

Kan yaymasında normalde görülen lökositler; nötrofiller, eozinofiller, bazofiller, lenfositler ve monositleri içerir. Olgunlaşmamış miyeloid hücrelerin (miyelositler, metamiyelositler, promiyelositler ve blastlar) varlığı ayırıcı biçimde anormaldir. Manuel lökosit alt tip sayımı için en az 100 hücre belirlenmeli ve sayılmalıdır. Alt tip sayımı yaparak lökositlerin relatif popülasyonlarının tanımlanmasına ek olarak hücreler sitoplazma ve çekirdekteki morfolojik anormallikler yönünden yakından incelenmelidir. Örneğin, enfeksiyon veya büyüme faktörü tedavisi genellikle nötrofillerde primer (azurofilik) granüllerin görülmesinde artışa yol açar, buna toksik granülasyon adı verilir. Buna karşılık, pek çok miyelodisplastik bozukluk anormal çekirdek segmantasyonunun yanısıra nötrofillerde hipogranülarite ile karakterizedir. Bazı depo bozukluklarında veya lizozomal bozukluklarda sitoplazmik inklüzyonlar görülebilir(241).

 

3.5.12.1.1. Eritrositler

 

Sağlıklı bir kişinin kanında eritrositler, bir arada bulunmadıklarında çapları 6-8 mikrometre arasında değişen, dairesel, aşağı yukarı aynı büyüklükte homojen diskler şeklinde görülür (Şekil 50). Ancak normal kanda bile, ayrı hücreler 5.5 mm kadar küçük ve 9.5 mm kadar büyük olabilir. Her hücrenin ortası perifere göre biraz daha soluktur. Hastalık durumunda eritrositlerin hemoglobin miktarı, büyüklüğü, şekli ve boyanma özellikleri ile yapısı değişir. Bu değişiklikler aşağıda anlatılmıştır(41, 242).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

           

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

        Şekil 50.Periferik Yaymada Normal Olgun Eritrositlerin Görünüm

 

 

 
 

 

 

3.5.12.1.1.1. Hemoglobin İçeriği

 

Boyanmanın derinliği eritrositlerdeki hemoglobin miktarı hakkında kabaca fikir verir ve normokromik, hipokromik ve hiperkromik terimleri eritrositlerin bu özelliğini ifade etmek için kullanılır. Normokromik normal boyanma yoğunluğunu ifade eder (Şekil 37/A). Hemoglobin miktarı azaldığında ortadaki soluk bölge daha büyük ve daha soluk hale gelir. Buna hipokromi (şekil 37/B) adı verilir. MCH ve MCHC azalır . Megaloblastik anemide eritrositler daha büyük ve dolayısıyla da daha kalın olduğundan, pek çoğu derinlemesine boyanır ve ortadaki solukluk daha azdır (Şekil 37/C). Bu hücreler hiperkromiktir çünkü MCH’leri artmıştır ancak MCHC’leri normaldir. Kalıtsal sferositozda da hücreler hiperkromiktir. MCH normal olsa da, azalmış yüzey/volüm oranı nedeniyle MCHC genellikle artar. Aynı yaymada hipokromik hücrelerin ve normokromik hücrelerin varlığına anizokromi veya bazen dimorfik anemi adı verilir(Şekil 51). Bu durum sideroblastik anemilerin karakteristiğidir ancak demir eksikliği anemisinde demir tedavisinden haftalar sonra veya hipokromik anemide normal hücrelerin transfüzyonundan sonra da ortaya çıkabilir(41).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

A

 

           

               

                       

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

      

 

 

 

                                                                  

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 51. Demir Eksikliği Anemisinde Hipokromi, Anizositoz ve Poikilositoz (A:100x,B:1000x)

3.5.12.1.1.2. Polikromatofili

 

Eritrositlerde hafif mavi-gri renk (polikromatofili veya polikromazi) hemoglobinin asit boyalara afinitesi ile RNA’nın bazik boyalara afinitesinin bir kombinasyonudur. Eritrositte rezidüel RNA genç bir eritrositin kanda bir-iki gün kaldığını gösterir. Bu hücreler olgun eritrositlerden daha büyüktür ve ortalarında solukluk olmayabilir(Şekil 52). Rezidüel RNA bulunan genç hücreler Wright boyası ile boyanmış ve ortam havasında kurutulmuş yaymalarda polikromatofilik eritrositler ve parlak krezil mavisi ile supravital boyandıklarında görülen hücreler retikülositlerdir. Dolayısıyla, artmış polikromazi retikülositozu düşündürür; en çok hemolizde ve akut kan kaybında belirgindir.

 

 
 

 

 

 

A

        

                                        

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

          B

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

Şekil 52. A.Polikromazi. B.spesifik tedavi alan megaloblastik anemili hastanın periferinden leishman boyasıyla boyanmış bir  preparatda polikromazi

 

3.5.12.1.1.3. Büyüklük

 

Eritrositler anormal derecede küçük (mikrositler) ve anormal derecede büyük (makrositler)(Şekil 53/A) olabilirler veya büyüklük açısından anormal değişkenlik gösterebilirler (anizositoz). Anizositoz çoğu aneminin bir özelliğidir; derecesi yüksek olduğunda hem makrositler hem de mikrositler mevcuttur (Şekil 53/B). Anemi analiz edilirken mikrositik ve makrositik terimleri hücre çapından çok hücre hacmi dikkate alındığında en fazla anlama sahiptir. MCV doğrudan çok-kanallı bir analizörde ölçülür. Çap doğrudan kan yaymasından saptanır ve ondan volüm ve hemoglobin miktarı belirlenir. Ayrıca, sferositozlu hastaların kanındaki hücrelerin pek çoğunun çapı küçük olsa da normalden daha kalın oldukları için volümleri azalmadığı için MCV normal aralıktadır.

 

 

 
 

 

.

                

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                         B

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                               Şekil 53. A.Makrositer ve B.

 

 Mikrositer Hücreler

 

 

3.5.12.1.1.4. Şekil

 

Şekildeki farklılığa poikilositoz adı verilir.Anormal şekilli herhangi bir hücre poikilosittir.Oval, armut şekilli, gözyaşı damlası şekilli, eyer şekilli, miğfer şekilli ve düzensiz şekilli hücreler megaloblastik anemi gibi tek bir anemi durumunda görülebilir(Şekil 54).

 

 
 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 54.Poikilositoz. Eritrositler değişik şekillerde görülmektedir. Bu yayma genellikle gözyaşı   hücreleri ile karakterize minimal değişiklikler göstermektedir.

 

 

 

Eliptositler kalıtsal eliptositozda en yaygın şekilde bulunur (Şekil 55); burada hücrelerin çoğu elips şekillidir. Eliptositoz bazen hemolitik anemi ile ilişkili olan dominant bir hastalıktır. Eliptositler normal insan kanında bulunurlar ancak sayıları %10’dan azdır. Ancak demir eksikliği anemisi, miyelofibroz ile birlikte miyeloid metaplazi, megaloblastik anemiler  ve orak hücreli anemide daha yaygındırlar.

 

 

 
 

 

 

 

 

 

B

A

            B

                    

 

        

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 55. Eliptosioz.  A. Hücreler Oval Veya Sigara Şeklinde Görülür.  B.İkinci Şekil Psödo Eliptositoz.

 Genellikle Artefaktırlar.

 

 

  • Sferositler normal bikonkav disklerin aksine neredeyse küresel eritrositlerdir. Çapları normalden küçüktür(Şekil 56). Ortalarında soluk bölge yoktur veya merkezden uzakta, daha küçük bir soluk bölgeye sahiptirler. Çünkü hücre daha kalındır ve lam üzerinde tamamen düz durmak yerine hafif eğimli dururlar. Bu hücrelere kalıtsal sferositozda (HS), bazı otoimmün hemolitik anemi(AHA) olgularında  ve hücrelere yönelik doğrudan bir fiziksel veya kimyasal hasar(ısı gibi) olduğunda rastlanır. Bu üç durumdan herbirinde küçük membran parçaları(hemoglobin fazlası) erişkin eritorsitlerden uzaklaştırılır ve geriye yüzey/volüm oranı azalmış hücreler kalır. HS ve AHA’da bu hücreler retiküloendotelyal sistemde ortaya çıkar; diğer durumlarda (vücut yanıkları olan hastalar gibi) ise intravasküler bölgede olabilir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

             

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 56. A.düşük ve B. Yüksek güçte sferositlerin görüntüsü.( eritrositler normalden sferik formdadır. Bu hücreler daha koyu boyanır ve daha küçük çaplı oluşlarıyla tanınırlar)

 

  • Hedef hücreler normalden daha ince olan eritrositlerdir ve boyandıklarında ortada koyu renkte hemoglobin içeren bir bölgenin bulunduğu periferik bir hemoglobin halkası gösterirler(Şekil 57). Bunlar hücre yüzey membranında artış olan obstrüktif sarılıkta, hücre yaşlandıkça yüzey membranında normal azalmanın olmadığı postsplenektomi durumunda, hipokromik herhangi bir anemide (özellikle talasemi) ve hemoglobin C hastalığında saptanır.

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

              B

 

 

       

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                       

 

 

Şekil 57. A.Βeta–Thalassemi Minörlü bir hastanın periferinde target hücrelerine eşlik eden hipokromi ve anizositoz poikilositoz  b. İkinci şekil aynı hastanın target hücrelerinin dominant olduğu başka bir alandaki görüntüsü.

 

Şistositler(hücre fragmanları) megaloblastik anemide, ciddi yanıklarda veya mikroanjiyopatik anemide  hemoliz varlığını gösterir(Şekil 58). Sonraki durum küçük kan damarlarında fibrin veya küçük kan damarı hastalığı ile ilişkilidir ve intravasküler fragmantasyona yol açar; miğfer şekilli hücreler ve üçgen şekilli hücreler özel karakteristiktir. Burr hücreleri düzensiz kontrakte eritrositlerdir ve belirgin spiküllere sahiptir ve aynı süreçte gözlenir; ancak bu eritrositler farklı hematologlar tarafından farklı şekillerde kullanılmakta ve kafa karışıklığına yol açmaktadır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                    

            

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

           Şekil 58. Burr Hücreleri. Üremi ve mikroangiopati gibi durumlarda fragmente şistositlerle beraber  bulunur.

 

 

                 

  • Akantositler düzensiz spiküllü kırmızı hücrelerdir ve spiküllerin uçları şişkin ve yuvarlaktır; bunlar kalıtsal veya edinsel abetalipoproteinemide ve belirli karaciğer hastalığı olgularında görülür. Tırtıklı hücreler veya ekinositler düzenli kontrakte hücrelerdir ve yaygın olarak yaymaların hazırlanması sırasında artefakt şeklinde görülebilirler veya hiperozmolarite veya diskosit-ekinosit dönüşümüne bağlı olarak ortaya çıkabilirler(Şekil 59). İn vivo koşullarda çeşitli nedenlerle eritrositteki adenozin trifosfat (ATP) düzeyindeki azalmayla ilişkili olabileceği yönündedir. Eritrositlerin  içine girinti yapan küçük boşluklar veya kabarcıkları içeren ve tırtıklı hücreleri andıran artefaktlar. Bu wright boyası ve fiksatif olarak kullanılan metanol ve kontamine eden  çok az miktardaki sudan kaynaklanabilir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

              

         

                   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                         

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 59.  Akantositler: hücre emmbranının düzensiz dalgalanmasını gösterir Bu görünüm genellikle eritrositlerin hipertonik tuzlu veya hücrelerin sıvı kaybından kaynaklanır.

 

 

 

 

3.5.12.1.1.5. Bazofilik Noktalanma (Noktalı Bazofili)

 

Eritrosit içerisinde düzensiz bazofilik granüllerin varlığıyla karakterize bir durumdur.  Granüller küçük veya kaba olabilir(Şekil 60). Wright boyasıyla koyu mavi boyanırlar. Bunları içeren eritrositler diğer açılardan normal şekilde boyanabilirler veya polisitokromatofili sergileyebilirler. Küçük noktalanma artmış polisitokromatofilinin ve dolayısıyla eritrositlerin üretiminde artışın görüldüğü durumlarda ortaya çıkar. Kaba noktalanma kurşun zehirlenmesi veya hemoglobin sentezinin bozulduğu diğer hastalıklarda, megaloblastik anemide ve diğer şiddetli anemi formlarında görülebilir; genç hücrede anormal RNA instabilitesi ile ilişkilendirilir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 60. Bazofilik Noktalanma.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

İçerisinde inorganik demir içeren granüller (bulunan eritrositlere siderositler adı verilir. Bunlar demire özgü boyalarla gösterilir. Bazen bu granüller Wright boyasıyla boyanır; boyandıklarında bunlara Pappenheimer cisimcikleri adı verilir. Bazofilik noktalanmanın aksine, Pappenheimer cisimcikleri belirli bir eritrositte az sayıda bulunur ve splenektomi haricinde periferik kanda nadiren görülür(Şekil 61).

 

          

 

       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  Şekil 61. Pappenheimer Cisimcikleri

 

 

 

3.5.12.11.6. Howell-Jolly Cisimcikleri

 

Bu partiküller nükleer kromatinin düzgün, yuvarlak kalıntılarıdır. Tekli Howell-Jolly cisimcikleri megaloblastik anemide, hemolitik anemide ve splenektomiden sonra görülebilir. Tek bir hücrede çok sayıda Howell-Jolly cisimciği (Şekil 62) megaloblastik anemi veya başka bir anormal eritropoez formunu düşündürür.

 

 

 

 

 

 

 

   

      

           

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  Şekil 62. Pernisiyoz anemide Howel-jolly cisimcikleri içeren makrositik eritrositler

 

 3.5.12.1.1.7. Kabot Halkaları

 

Bunlar halka şeklinde, 8 rakamı şeklinde veya çember şeklindeki yapılardır. Bazen iki veya daha fazla konsantrik çizgiyle oluşurlar(Şekil 63). Bunlar pernisyöz anemide, kurşun zehirlenmesinde ve belirli başka eritropoez hastalıklarında eritrositlerde nadiren görülürler. Wright boyasıyla kırmızı veya kırmızımsı mor şeklinde boyanırlar ve içlerinde yapılar yoktur. Bu halkalar muhtemelen mitoz mekiğinden kalan mikrotübüllerdir. Anormal eritropez kanıtı olarak yorumlanırlar.

 

 

                                  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

      Şekil  63. Kabot Halkaları

 

 

 

 

 

3.5.12.1.1.8. Malaryal Noktalanma

 

Plasmodium vivax içeren eritrositlerde küçük granüller görülebilir. Wright boyasıyla küçük granüller (“Schüffner granülleri”) morumsu kırmızı renkte boyanır( Şekil 64/A). Bunlar bazen sayıca o kadar fazladır ki, parazitleri maskelerler. Bu eritrositler kural olarak normalden büyüktür.

 

 

 

       
 
 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 64. A. P.Vivax Enfeksiyonlarında Rozet Yüzük Şeklindeki Hücreler Ve B.Şizont Gelişimi

 

3.5.12.1.1.9. Rouleaux (Rulo) Oluşumu

 

Bu durum eritrositlerin birbirinin üzerine yığılmaları sonucunda madeni para şeklinde görülmeleridir (Şekil 65). Ortam havasında kurutulan yaymalarada rulolar görülür. Plazma fibrinojen ve globulin düzeyinin yükseldiği durumlarda rulolar oluşur ve aynı zamanda bu parametreler eritrosit sedimantasyon hızını arttırırlar. Rulo oluşumu paraproteinemide (monoklonal gammopati) özellikle belirgindir. Eritrositlerde aglütinasyon veya kümeleşme ıslak preparatlarda rulolardan daha emin şekilde ayırt edilir ve ortam havasında kurutulan yaymalarda doğrusal rulolar yerine daha düzensiz ve yuvarlak kümeler görülür. Bu görünümden soğuk aglutininler sorumludur.

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Şekil 65. Belirgin ve Orta Düzeyde Rulo Formasyonu

 

 

 

3.5.12.1.1.10. Çekirdekli Kırmızı Hücreler (nRBC’ler)

 

Çekirdekli kırmızı hücreler(normoblastlar, nRBC’ler) kanda çekirdeksiz olgun eritrostilerin prekürsörleridir. İnsanda nRBC’ler  sadece kemik iliğinde bulunur (Şekil 66 ). Oluşum basamakları (erken dönemden geç döneme) pronormoblast, bazofilik normoblast, polisitokromatofilik normoblast ve ortokromatik normoblasttır.

Genellikle, hastalık durumunda kanda ortaya çıkabilen çekirdekli kırmızı hücreler polikromatik normoblastlardır. Ancak bazılarında sitoplazma o kadar bazofiliktir ki, çekirdeğin karakteri, yoğun boyanan kromatin ve kromatinin parakromatinden keskin şekilde ayrılması dışında hücreyi eritroid olarak tanımak zordur. Bu tip eritroid hücreler hatalı olarak lenfositler şeklinde algılanır; bu hata çekirdeğin dikkatli incelenmesiyle genellikle giderilir. Megaloblast sadece daha büyük bir normoblast değil, ayrı, çekirdekli bir eritroid hücredir. Büyük boyutları ve anormal “açık” nükleer kromatin paterni ile karakterizedir. Bu dizideki hücreler normal ilikte bulunmaz ancak pernisiyöz anemi veya başka megaloblastik anemileri olan hastaların iliğinde ve bazen de kanında karakteristik olarak mevcuttur( Şekil 66/C).

Kanda nRBC’lerin ve nötrofilik serinin olgunlaşmamış hücrelerinin varlığı lökoeritroblastotik reaksiyon olarak adlandırılır. Miyeloid metaplazili miyelofibroz, metastatik karsinom, lösemiler, multipl miyelom, Gaucher hastalığı gibi genellikle ilikte yer kaplayan bozuklukları gösterir(248). Metastatik malignite olan hastalarda lökoeritroblastotik reaksiyon ilikte tümör tutulumunun iyi bir göstergesidir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

         

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                     C

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 Şekil 66. A-B. Periferik Kanda Late Megaloblastlar.C. Megaloblastik Anemide nRBC’ler

 

 

 

 

 

 

 

3.5.13. Manuel Lökosit Alt Tip Sayımında Hata Kaynakları

 

Çok iyi hazırlanmış periferik yaymalarda bile, lökosit alt hücre sayımı rastgele dağılım hatalarına açıktır. Aynı hastada günden güne veya lamdan lama farkların yorumlanmasında, farklılığın ne kadarının sadece tesadüfe bağlı olduğunun belirlenmesi yararlıdır(249). Tablo 28’de toplam 100-1000 lökosit sınıflanarak yapılan alt tip sayımlarında hücrelerin farklı yüzdeleri için %95 güven limitlerini göstermektedir. İki ayrı sayımdaki yüzdeler karşılaştırılırken, bir rakam diğerinin güven limitlerinin dışında kalırsa, farkın anlamlı olması muhtemeldir (tesadüfe bağlı değil). Dolayısıyla, 100 hücre içeren bir alt tip sayımında monositler birinci günde %5 ve ertesi gün %10 ise, farkların sadece örnekleme hatasına bağlı olması muhtemeldir. Fark gerçek olsa bile, az sayıda hücre sayıldığından bundan emin olunmaz. Öte yandan, alt tip sayımında toplam 500 hücre varsa, %5-%10 arasındaki fark anlamlıdır; farkın gerçek olduğu ve tesadüfe bağlı olmadığından emin olunabilir (hata olasılığı %5). Elbette, bu alt tip sayımlarında ortaya çıkan hataların minimal tahminidir çünkü mekanik hataları (kan örneklerinin alınması, yetersiz karışım, yaymanın tip ve kalitesine bağlı olarak dağılım düzensizlikleri ve iyi boyanmamadan kaynaklanan farklılıklar) veya hücrenin tanımlanmasındaki hataları (gözlemcinin yargısına ve deneyimine dayanır) içermez. Titizlikle uygulanan teknik ve doğru ve tutarlı hücre sınıflaması gerekir. Sonuçları yorumlayan kişiler olası hata kaynaklarının özellikle de hücrelerin dağılımında tesadüfe bağlı hataların farkında olmalıdır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tablo 28. Lökosit  Alt Tip Sayımlarında Tayin Edilen Hücrelerin Farklı Yüzdeleri İçin %95 Güven Limitleri

A

N=100

    N=200

N=500

N=1000

N=10000

 

0

 

0.0-3,6

 

0,0-1,8

 

0,0-0,7

 

0,0-0,4

 

0,0-0,1

1

0,0-5,4

0,1-3,6

0,3-2,3

0,5-1,8

0,8-1,3

2

0,0-7,0

0,6-5,0

1,0-3,6

1,2-3,1

1,7-2,3

3

0,6-8,5

1,1-6,4

1,7-4,9

2,0-4,3

2,6-3,4

4

1,1-9,9

1,7-7,7

2,5-6,1

2,9-5,4

3,6-4,5

5

1,6-11,3

2,4-9,0

3,3-7,3

3,7-6,5

4,5-5,5

6

2,2-12,6

3,1-10,2

4,1-8,5

4,6-7,7

5,5-6,5

7

2,9-13,9

3,9-11,5

4,9-9,6

5,5-8,8

6,5-7,6

8

3,5-15,2

4,6-12,7

5,8-10,7

6,4-9,9

7,4-8,6

9

4,2-16,4

5,4-13,9

6,6-11,9

7,3-10,9

8,4-9,6

10

4,9-17,6

6,2-15,0

7,5-13,0

8,2-12,0

9,4-10,7

15

8,6-23,5

10,4-20,7

12,0-18,4

12,8-17,4

14,3-15,8

20

12,7-29,2

14,7-26,2

16,6-23,8

17,6-22,6

19,2-20,8

25

16,9-34,7

19,2-31,6

21,3-29,0

22,3-27,8

24,1-25,9

30

21,2-40,0

23,7-36,9

26,0-34,2

27,2-32,9

29,1-31,0

35

25,7-45,2

28,4-42,0

30,8-39,4

32,0-38,0

34,0-36,0

40

30,3-50,3

33,2-47,1

35,7-44,4

36,9-43,1

39,0-41,0

45

35,0-55,3

38,0-52,2

40,6-49,5

41,9-48,1

44,0-46,0

50

39,8-60,2

42,9-57,1

45,5-54,5

46,9-53,1

49,0-51,0

55

44,7-65,0

47,8-62,0

50,5-59,4

51,9-58,1

54,0-56,0

60

49,7-69,7

52,9-66,8

55,6-64,3

56,9-63,1

59,0-61,0

65

54,8-74,3

58,0-71,6

60,6-69,2

62,0-68,0

64,0-66,0

70

60,0-78,8

63,1-76,3

65,8-74,0

67,1-72,8

69,0-70,9

75

65,3-83,1

68,4-80,8

71,0-78,7

72,2-77,7

74,1-75,9

80

70,8-87,3

73,8-85,3

76,2-83,4

77,4-82,4

79,2-80,8

85

76,5-91,4

79,3-89,6

81,6-88,0

82,6-87,2

84,2-85,7

90

82,4-95,1

85,0-93,8

87,0-92,5

88,0-91,8

89,3-90,6

91

83,6-95,8

86,1-94,6

88,1-93,4

89,1-92,7

90,4-91,6

92

84,8-96,5

87,3-95,4

89,3-94,2

90,1-93,6

91,4-92,6

93

86,1-97,1

88,5-96,1

90,4-95,1

91,2-94,5

92,4-93,5

94

87,4-97,8

89,8-96,9

91,5-95,9

92,3-95,4

93,5-94,5

95

88,7-98,4

91,0-97,6

92,7-96,7

93,5-96,3

94,5-95,5

96

90,1-98,9

92,3-98,3

93,9-97,5

94,6-97,1

95,5-96,4

97

91,5-99,4

93,6-98,9

95,1-98,3

95,7-98,0

96,6-97,4

98

93,0-99,9

95,0-99,4

96,4-99,0

96,9-98,8

97,7-98,3

99

94,6-99,9

96,4-99,9

97,7-99,7

98,2-99,5

98,7-99,2

100

96,4-100,0

98,2-100,0

99,3-100,0

99,6-100,0

99,9-100,0

 

N=sayılan hücre sayısı; a:belirli hücrelerin gözlenen yüzde değerleri.Limitler 100,200, 500, ve 1000 verilmiştir.n=10.000 Freeman tayin ettiği değerlerdir. Courtney of Prof. C. L. Rümke’nin verilerinden alınmıştır.

 

 

Manuel hücre alt tip sayımları çeşitli hücre tayin hatalarına açıktır; bunların bazıları gözlemcinin eğitim düzeyine ve deneyimine, bazıları ise motivasyon, yorgunluk, stres veya dikkat kaybı düzeyine bağlıdır. Teknisyenlerin karşılıklı eğitimine ilişkin güncel uygulamalarda mikroskopik analizin yetersiz uygulanması nedeniyle problemler oluşabilir. Bunda renk körlüğü de rol oynayabilir ancak bu bir kişinin morfolog olarak kabul edilmemesine yol açmamalıdır. Gözlemcinin emin olmadığı hücreleri sayımda “atlaması” şeklindeki yaygın uygulama kesinlikle önlenmelidir çünkü anlamlı morbiditenin gözden kaçırılmasına neden olabilir.

Belirli hücre tiplerinin gözlemciler arasında daha büyük uyumsuzluğa yol açtığı da bilinmelidir: gözlemciler eozinofil sayımlarında nadiren uyumsuzluk gösterirler ancak monosit veya bant nötrofil sayımlarında sıklıkla uyumsuzdurlar. Bu uyumsuzluğun  nedeni, eozinofiller için morfolojik kriterlerin kolaylıkla tanımlanması ancak küçük bir monositin büyük, granüllü bir lenfositten (NK hücresi) ayırt edilmesinin zor olmasıdır. Genellikle en düşük tekrarlanabilirlik ve doğruluk sonuçları aynı dizi içerisinde farklı olgunlaşma düzeylerine sahip hücrelerin sayımında gözlenir. Örnekler bant ve segmentli nötrofillerdir ve daha az sıklıkla, olgunlaşmamış (promiyelositler, miyelositler ve metamiyelositler). granülositlerdir: Çok sayıda gözlemci ile morfolojik kriterlerin tutarlı olarak uygulanmasının çok zor olduğu ve farklı kurumlar veya ülkelerde bunun daha da zorlaştığı bilinmektedir. Dolayısıyla, hücre tiplerinin morfolojiye göre  subjektif ayrımı sıklıkla tutarsız sonuçlara yol açar: elektronik hücre analizi, monoklonal antikora dayalı akış sitometrisi veya görüntü analiz algoritmaları lökosit popülasyonlarına uygulandığında tutarsızlık olasılığı azalır.

 

3.5.14. Periferik Yaymalarda Morfolojik Değerlendirmedeki Farklılıklar  

 

            Eritrositlerin morfolojisinin tanımlanmasında kantitatif terminolojinin kullanımında ve değişik ülkeler arasında standardizasyon yoktur. Birçok ülke periferik yayma çalışmalarında kaliteyi geliştirmek için çalışmalar yapmaktadır(253). Burada esas amaç incelemeyi yapan teknisyen ve laboratuvardan kaynaklanan bağımsız değişkenlerin standardize edilmesidir. Genellikle kullanılan kriterler ve terminolojide anlamlı farklılıklarla karşılaşılmaktadır. Bu farklar 6 başlık altında incelenebilir.

1.     İlk olarak; laboratuvar aynı durum için  “önemsiz” ,“nadir” ,”aralıklı” , “birkaç adet” , “ılımlı” , “ orta” , ve “ + ” gibi terimler kullanılmaktadır.

2.     İkinci olarak “band” ve segmente nötrofil arasındaki fark sorunuda aşikardır. “hipersegmentasyon”ve “stab” teknisyenleri olduğu gibi aynı zamanda “yüksek band” ve “düşük band” diye yorumlayan  labarotuarlar da bulunmaktadır.

3.     Üçüncü olarak;  mikro veya makrositoz bulunduğunu saptamada kullanılan kesin kriterler bulunmamaktadır. “Normal” bir dağılım bulunması halinde bile, bunlar sıklıkla anormallik veya anizositoz şeklinde bildirilmektedir.

4.     Dördüncü olarak; atipik lenfositleri tanımlarken “hiperbazofilik lenfosit” “monosite-benzer lenfosit”, “lenfosit-benzer monosit”, “plazmasellüler lenfosit”, “virosit”, pfeiffersel” ve “lenfomonosit”, “mononükleozis infeksiosa hücresi” gibi isimlendirmeler kullanılır.

5.     Beşinci olarak; hücreler ve anomallikleri tanımlamada kullanılan dilde farklılık vardır.

6.     Son olarak, preparatların mikroskopik incelemelerinde kullanılan prosedür de tektip (üniform ) değildir.

 

 Eritrositler hem kalitatif hem kantitatif ana noktaları ile formüle edilmelidir. Kalitatif ana hatları formüle ederken, büyüklük, renk, biçim ve muhtemel inklüzyonlar olduğu kadar, normal eritrositler de tanımlanmalıdır. İsimlendirme, anormalliklerin tanımlanması ve bu anormalliklerin göstereceği hastalıklar da tanımlanmalıdır. Çeşitli boyama metodlarının test edilerek karşılaştırılma yapılarak boya metodu seçilmelidir. Mikroskopik değerlendirme prosedürleri de önerilmektedir. Kantitatif ana ilkeler formülasyonu, mikroskop tipi, magnifikasyonu, ve yayma tekniklerindeki farklılıklardan dolayı birim alana düşen hücre sayısını kullanarak yapılan kantifikasyon gibi uygulamalardır. Genel olarak geçerli bir yöntem olan 1000 eritrosite düşen hücreyi saymak yoğun emek isteyen ve rutin uygulamalarda kullanılmayan bir metodtur. Teknisyenlerin birim alana düşen hücreleri sayıp bu sonuçları her 1000 eritrosit için formüle ederek sonuç vermelidirler. Bu sistemde hafif, ılımlı gibi terimler kullanmak yerine “+”, “++” ve “+++” ifadelerin kullanması tercih edilmelidir. Hücre anormallikleri, büyüklükleri, formu, rengi ve inküzyonları tanımlamak için kantitatif kriterler formüle edilmelidir.

Sonuç olarak kemik iliği ve periferik kan hücrelerinin yorumlanmasında  standartizasyon gerekmektedir. Bundan dolayı tüm laboratuar sorumluları ve hematoloji uzmanları için eğitim programları uygulanmalıdır. Yeni prosedürle ilgili testleri uygulayan laboratuvar diğer hastane doktorları ve genel pratisyenlere detaylı bilgi vermelidir. Sonuçlar ülkenin tümünde bir bütünlük oluşturmalıdır. Tıbbi laboratuvarda standardizasyon eksikliği laboratuvalar için önemli bir problemdir. Yorumlama hataları, laboratuvar ve hekimler arasında yanlış iletişimi arttırmakta ve hekimlerin kararlarında yanlışlıklara neden olabilmektedir.

 

3.5.15. Hücre Alt Tipi Sayımı Uygulamaları

 

Lökosit alt tip sayımının temeli Paul Ehrlich ve diğer araştırmacıların bundan yüzyılı aşkın süre önce anilin boyaları kan hücre preparatlarına uygulamaları ve kan hücrelerini mikroskopla tayin için görülür hale getirdikleri günlere uzanmaktadır(248). Bazı lökosit alt tip sayım uygulamaları bugün demode gibi görünse de ve klinisyenlerin bunların sayılarına duydukları güven herzaman kanıtlanamasa da, testin klinik bilgi ve karar alma için güçlü destekleyici veriler sağladığı inkar edilemez.

Hematopoetik ağaç primitif kök hücreden tam farklılaşmış, fonksiyonel son hücrelere kadar incelendiğinde, farklılaşma yolları ayırt edilebilir ve ağacın dallarının fonksiyonel son hücrelerine farklı sayımlar uygulanabilir. Farklılaşma ve olgunlaşma terimleri kabaca eşdeğer kabul edilecektir ve her ikisi de olgun olmayan bir hücreden olgun, fonksiyonel son hücre aşamasına doğru hücresel değişimin (hücre bölünmesi + hücre değişikliği veya sadece hücre değişikliği) devam eden fizyolojik sürecini tanımlamak için kullanılır. Fonksiyonel son hücrelerin ayrı sayımları farklı hücre dizilerini birbirinden ayırır ve bir kan veya kemik iliği örneğinde bu dizilerin dağılımındaki değişiklikleri gösterebilir. Belirlenmiş bir referans aralığıyla karşılaştırıldığında bu gösterge klinik açıdan yararlı bilgiler sağlayabilir. Artmış lenfosit sayısı (özellikle atipik veya varyant morfolojili) enfeksiyöz mononükleozis gibi belirli viral enfeksiyonlar ile ilişkili olabilir. Diğer viral enfeksiyonlar (örn., insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile ilişkili olanlar) dolaşımdaki lenfosit sayısında azalmaya yol açabilir.

Hücre alt tip sayımının kan hücrelerinin farklı tiplerde fonksiyonel son hücrelere (diziler) ayrılmasından ibaret olmadığının anlaşılması önemlidir; tek bir dizi içerisinde farklı olgunlaşma düzeylerindeki hücrelerin dağılımı hakkında bir fikir verebilir. Ancak alt tip sayımı sadece morfolojik tayin ile yapıldığında anlamlı sınırlamalar mevcuttur. Diziler birbirlerinden kolaylıkla ayırt edilebilse de yatay hücre sayımı; Şekil 67/B), basamaklı morfolojik kriterleri (segmentli nötrofillere karşılık bant veya stab hücreleri) tek bir hücre dizisi içerisinde biyolojik farklılaşma seyrine uygulamak kolay değildir dikey hücre sayımı; Şekil 67/D). Bu nedenle, sola kaymayı morfolojik yollarla tayin etmek zordur. Sola kaymanın doğru tanımlanması özellikle yenidoğanlarda ve yaşlı popülasyonda bakteriyel enfeksiyonun tanımlanmasında yararlı olabilir ancak sola kaymayı oluşturanın morfolojik özellikleri hakkında görüş birliği yoktur. Dikey alt tip sayımının diğer bir formu promiyelositler, miyelositler ve metamiyelositler gibi daha da az olgunlaşmış nötrofillerin tayininde görülür. Bu,  spesifik hücre tipleri arasında zorluklara yol açabilir ancak grup olarak olgunlaşmamış granülositler bunlar olgun nötrofiller ve bant formlarından ayırt edilebilmek için morfolojik açıdan yeterince farklıdırlar.

Yeni nesil hematoloji kan hücre analizörleri ile kemik iliği analizi de yapılmaktadır. Bir uygulama miyeloid: eritroid oranını (M: E) daha etkin biçimde belirlemektir. Diğerleri blast hücre sayımlarını ve miyeloid farklılaşma paternlerini içerir. Yeni teknolojik gelişmeler eritroid serilerde de olgunlaşma davranışlarını inceleme olanağını sağlamıştır. Klinik laboratuara geliştirilmiş differential sayımın(EDC) girişiyle birlikte, kemik iliği ve vücut sıvısı örneklerinin elektronik analizinin hızla artacağı ve manuel mikroskopinin yerini büyük ölçüde alacağı öngörülmektedir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 67. Hematopoetik ağaç. A. Hamatopoezde stem cell modelin şematik gösterilişi. B. Her nesilin ayrılması ve büyümesi prosesi C. Yatay hücre sayımında fonksiyonel son hücreler D.Dikey Hücre Sayımında belirli nesil hücreleri

 

Vertikal alt tip sayımı hematopoetik kemik iliğindeki olgunlaşma ve farklılaşma süreçlerinin değerlendirilmesinde yardımcı bir araçtır ( Şekil 53 ). Vertikal alt tip sayımının rollerinden biri olgunlaşmamış retikülosit fraksiyonu (IRF) ile benzerdir. IRF olgunlaşmamış retikülositlerin çoğunun sayısını kendileri de olgunlaşmamış kırmızı kan hücreleri olan tüm retikülositlerin oranı şeklinde gösterir. Retikülosit sayılarının eritrosit yapım hızını (eritropoez) yansıttığı iyi bilinse de, IRF’nin kesin rolü birçoklarına göre henüz tam olarak tanımlanmamıştır. IRF ile retikülosit sayıları arasındaki kinetik ilişkiye bakıldığında IRF’nin retikülosit sayısından farklı olduğu anlaşılır. Bu durum kanser tedavisinin bir parçası olarak otolog kemik iliği tekrarlı infüzyonu alan hastada gösterilmiştir. Hasta stabilize edici sitotoksik rejimi aldıktan sonra, IRF değerleri retikülosit sayıları normalin altına düşmeden önce normalin altına iner. Buna karşılık, graftlanma gerçekleştikçe retikülosit sayıları yanıt vermeden önce retikülosit sayıları normale yükselir. Bu tip değişiklikler ve parametreler arasındaki ilişkiler yapım sürecinin genel olarak kabul edilen yorumlarına uygulandığında, retikülosit sayısının eritropoezin ilk göstergesini (RBC yapım hızı) temsil ettiği anlaşılır. Dolayısıyla IRF değişiklikleri eritrositlerin yapım hızındaki değişiklik hızını yansıtır (yapım hızının ikinci göstergesi). Olgunlaşmamışlık düzeyinin yüksekliği eritrositler yapım hızlarında artışı, daha az olgunlaşmamışlık ise azalmayı gösterir. Benzer şekilde, sola kaymış nötrofiller nötrofil yapım hızında artışı gösterir; bu durum tipik olarak enfeksiyondan veya G-CSF veya GM-CSF gibi hematopoetik büyüme faktörlerinin uygulanmasından kaynaklanır.

Uygun şekilde ifade edildiğinde (yani herhangi bir spesifik hücre dizisinde olgunlaşmamış hücrelerin oranı) vertikal alt tip oranı o dizinin yapım sürecinin ikinci göstergesine işaret edebilir(yapım hızındaki değişiklik oranı). ++

İkinci gösterge ölçümleri önemlidir çünkü değişiklikler gerçek kemik iliği veriminde (spesifik hücre sayıları) değişiklikler olmadan önce gözlenirler ve IRF’de güçlü predictiv değerlerine sahiptirler. Bu tip ölçümlerin miyeloid ve diğer diziler için kullanıma geçecek olması heyecan vericidir ancak bunlar henüz tam uygulanmamaktadır.

Miyeloid ve eritroid dizi için vertikal alt tip sayımı hematoloji analizörlerinde giderek rutin hale gelecektir ve zorluk bu tip parametrelerin laboratuara uyarlanması ve bunların klinisyenler için erişilebilir ve yararlı hale getirilmesinde yaşanacaktır.

Elektronik hücre tayini ve sayımı rutin laboratuar morfoloji sayımına eşdeğer veya onu aşan bir gelişmişlik düzeyine ulaşmıştır. Elektronik olarak yapılan lökosit alt tip sayımı manuel yöntemlerden çok daha fazla kesinliğe sahiptir ve doğrulukları çoğunlukla eşit veya daha iyidir. Hem maliyet hem de işlem süreleri elektronik sayımlar için daha azdır. Genişletilmiş alt tip sayımı laboratuarlara kemik iliği ve vücut sıvısı örnekleri gibi karmaşık örneklerde sayım yapma imkanı verir. Manuel gözden geçirme ihtiyacı giderek daha fazla azalacaktır ve yeni parametreler ortaya çıkabilir. Bunlar kemik iliği aspirasyonu veya biyopsi yapılmaksızın hematopoez kinetiklerini ölçme yöntemleri gibi gelişmeleri  içerebilir.

Elektronik alt tip sayımları ile elde edilenle karşılaştırıldığında, kan hücre popülasyonları ve onların öncülerinin rutin morfolojik analizi ile oldukça az bilgi elde edilir. Manuel, optik (morfolojik) lökosit alt tip sayımı 20.yüzyılın büyük kısmında lökosit alt popülasyonları analizinin temeltaşı olmuşsa da, Romanowsky ile boyanmış yaymaların morfolojik analizinden kaynaklanan sınırlamaların klinik kullanım potansiyelini etkilediği bilinmektedir.

 

3.5.16. Morfolojik Analizin Yerini Alan Teknolojiler

 

Kan ve kemik iliği gibi  diğer dokuların morfolojik analizi halen önemli bir role sahipse de, pek çok rutin amaçlar doğrultusunda onun yerini giderek başka teknolojiler almaktadır. Gelişmiş ülkelerin çoğunda lökosit ve eritrosit morfolojisinin periferik yayma ile değerlendirilmesi yerini büyük ölçüde, kan hücrelerinin sitokimyasal veya enzim sitokimyasal prosesiyle birlikte elektronik analiz formlarına bırakmıştır. Monoklonal antikor dayalı akış sitometrisindeki son gelişmeler  kan, kemik iliği ve lenf düğümü analizinin diğer alanlarına anlamlı katkılarda bulunmuştur(249). Morfolojik analizin yerini akış sitometrisinin alma derecesi tek bir ülkede kurumdan kuruma değişebilmektedir ancak son 15 yılda önemli düzeye ulaşmıştır. Bu eğilim geniş bir yelpazede monoklonal antikorların geliştirilmesi ve küme tanımlarının (CD’ler, cluster designations) hücresel fizyolojisi ve antikorların yöneltildikleri epitoplar hakkında daha fazla bilgi edinilmesiyle desteklenmiştir. Sadece monoklonal antikorlarla tanı koyma potansiyeli muazzam biçimde artmamıştır, aynı zamanda akışa dayalı sonuçların tarafsızlığından dolayı gözlemcinin kendi öznelliğinden etkilenen morfolojik yorumlamaya göre daha fazla tercih edilmektedir. Son olarak, büyük sayılardaki hücrelerin oldukça daha kolay analiz edilebilmesi akış sitometrisiyle elde edilen verilerin manuel mikroskopiye göre çok daha fazla kesinlik içermesini de sağlamıştır(250).

Tüm bu faktörlere ek olarak çok ileri düzeydeki cihazlar ve bilgisayar analizleriyle akış sitometrisini klinik kullanım için müthiş bir araç haline getirmiştir. Ayrıca akış sitometrisi hücre fizyolojisi hücre metabolizması, apoptozis ve ilaç yanıtı hakkında klasik morfolojik analiz ile elde edilemeyen bilgiler de verebilmektedir. Klasik morfoloji uygulamalarının bazı kısımlarının yerini alan diğer bir metodoloji dokuların ve hatta her bir hücrenin moleküler analizidir. Örnekler minimal rezidüel hastalığın saptanması, çoklu ilaç direncinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile saptanması ve ayrı hücrelerdeki kromozom anormalliklerinin floresan in situ hibridizasyon (FISH) teknikleri ile belirlenmesini içerir(251-252).

Klasik manuel mikroskopiye dayalı analizlerin rolü azaldıkça, hematoloji analizörleri ile elektronik hücre analizi, monoklonal antikorların kullanıldığı akış sitometrisi ve moleküler diagnostikler kan, kemik iliği veya vücut sıvılarındaki kan hücrelerini içeren tanısal yaklaşımlar da giderek daha güçlü roller oynayacaktır.

 

3.5.17. Otomatik Yömtemlerle Lökosit Alt Tip (Differantial) Analizi

 

Referans Lökosit Alt Tip Sayımı (Orantılı) ve Cihaz Yöntemlerinin Değerlendirilmesi

 

Otomatik lökosit alt sayım sistemleri klinik laboratuarı yoğun emek isteyen ve zaman alan bir çalışmadan kurtarmaktadır. Laboratuar personelinin becerisinin, değişen eğitimin ve görsel algılamanın yerini otomasyon alacağından sonuçların doğruluğu artacaktır. Ayrıca otomasyonla insan gözüyle inceleme ile sınıflanabilenden çok daha fazla hücrenin sayımıyla sonuçların kesinliği daha da artacaktır. Otomasyon için farklı düzeylerde birçok otomatik cihaz geliştirilmiştir. Bu farklı otomatik cihazların hedeflenen kullanımları ve örnekleri şunlardır:

 (1) Normalde dolaşımda bulunan hücreleri tablo halinde gösteren ve normalden diğer sapmalar veya herhangi anormal lökositler için işaret veren otomatik hücre saptayıcıları ve sınıflayıcıları

(2) Normal ve anormal lökositleri sınıflayan cihazlar; tarama için uygundur

(3) Tanı için uygun olan normal ve anormal lökosit sınıflayıcıları (işaretleme sistemleri)

(4) Yukarıda belirtilen kullanımlardan birine ek olarak insan kanında bulunan olgunlaşmış hücrelerin (lökositler, eritrositler ve/veya trombositler) paternlerini (büyüklük, şekil ve/veya boyanma) kalitatif ve/veya kantitatif olarak belirleyen cihazları içermektedir..

  Normalde insan kanında dolaşan hücrelere ek olarak bu hücrelerin tanımlanmasını herzaman gerektirmeyen hücreler diğer hücre kategorisi ile sınırlıdır. Dolayısıyla, klinik yönden anormal örneklerin görsel incelenmesi için işaretlemek performans değerlendirmesinin zorunlu bir parçasıdır. Lökositlerin kabul edilebilir referans aralıkları hakkındaki görüşler çeşitlidir ve bu tanımı karmaşıklaştırmaktadır. Mutlak sayılara karşılık orantılı (yüzde) sayıların arzu edilirliği konusunda anlaşmazlık vardır. Bu konuları adil biçimde ele almak için, bu standarttaki yöntemler kullanıcı tarafından belirlenen referans aralığı kriterleri ile birlikte kullanılmalıdır(210).

 

3.5.17.1. Dijital Görüntü İşlemcileri(Patern Tanıma Sistemleri)

(Periferik Yayma Lamlarını Kullanarak Patern Tanıma Esasıyla Hücre Tayini Yapanlar )

 

 Patern tanıma sistemleri ilk kez 1970’lerin başında piyasaya girmiştir ve Hematrack, Coulter diff 3 ve diff 4, Abbott\R ADC 500 ve Lökosit Otomatik Tanıma Sayım Cihazı gibi cihazları içerir. Bu teknoloji boyanan ve cihaza yerleştirilen periferik yayma lamlarını  kullanarak ölçüm yapar(255-256). Bilgisayar lökosit çekirdeğine karşılık gelen koyu boyanmış bir alan saptayana kadar mikroskobu mekanik olarak hareket ettirir. Bilgisayar her hücrenin hücre büyüklüğü, çekirdek ve sitoplazma rengi ve dansitesi hakkındaki verileri kullanarak veri paternlerini her bir lökosit tipi özellikleriyle eşleştirir ve hücreleri tanımlar. Patern tanıma teknolojisinin çoğu manuel sayımlar ile aynı  dezavantaja sahiptir. Bu dezavantajlar; sayılan hücre sayısının sınırlı olması, anormal hücre tiplerini sınıflamasındaki zorluklar ve hücre dağılım özellikleridir(257). Otomatik patern tanıma sistemleri teknisyenin harcadığı süreyi kısaltsa da  akışlı yöntemlere göre anlamlı olarak daha yavaştırlar. Dolayısıyla şu anda patern tanıma sistemleri nadiren kullanılmaktadır ve bu cihazlar artık üretilmemektedir.

Homojen hazırlanmış ve boyanmış periferik yayma motorla çalışan mikroskop basamağına koyulur. Bilgisayar lamı tarayarak kontrol eder ve sahada lökositler olduğunda taramayı durdurur. Optik detaylar örneğin, çekirdek ve sitoplazma büyüklüğü, yoğunluğu, şekli ve rengi  televizyon kamerasıyla kaydedilir,  bilgisayar tarafından analiz edilir ve dijital forma dönüştürülür; bu özellikler farklı hücre tiplerinin bu tip özelliklerini içeren hafızadaki bilgi bankasıyla karşılaştırılır. Patern normal hücre tipininki ile uyumluysa, hücre bu şekilde tanımlanır; aksi takdirde diğer veya bilinmiyor şeklinde tanımlanır. Bilinmeyen hücrelerin koordinatları cihaz tarafından saklanır ve teknisyenin sınıflama yapabilmesi için sayım sonunda tekrar gösterilir. Böyle sistem üreticileri kan boya bileşimi, stabilite ve tekrarlanabilirlik konularında anlamlı ilerlemeler kaydetmişlerdir(258).

Bu tip dört sistem piyasada mevcuttur ve klinik açıdan incelenmiştir: LARC (Lökosit Otomatik Tanıma Bilgisayarı) (Corning Medical Instruments, Medfield, MA), Hematrak (Geometric Data Corp, Wayne, PA), “diff-3 sistemi” (Coulter Electronics, Hialeah, FL) ve ADC-500 (Abbott Laboratories, Dallas, TX). Bu dijital görüntü işlemcilerinin sonuncusu (Hematrak) 1986’da piyasaya sunuldu. Bazı sistemleri hala kullanıldığından ve prensip önemli olduğundan, konu kısaca ele alınmaktadır.

Hematrak  Romanowsky boyasıyla boyanmış filmleri kullanır ve yaklaşık 40 saniyede 100 lökositi sınıflar. Eritrosit morfolojisi ve trombosit hesaplamaları sayımdan önce veya sonra yapılır(259). Otomatik retikülositler, otomatik trombosit sayıları ve otomatik eritrosit programları için programlar bulunmaktadır. Lökosit, anormal hücreler ve band nötrofilleri tanımlama özelliğinin tatmin edici olduğu bildirilmiştir(260). Sonraki Hematrak modelleri (480, 450, 450 QP ve 590 gibi) eritrosit morfolojisi ve trombosit sayıları ve lökosit alt tip sayımlarını yapabilmesi için lam kasetlerine sahiptir. Hematrak 590, 100 kan yaymasını yaklaşık 1,5 saatte test edebilir. Bu cihazlarda diğer patern tanıma cihazlarının aksine, lam veya santrifüjlenmiş yaymalar kullanılabilir.

1994’de Intelligent Medical Imaging (IMI), Inc. (Palm Beach Gardens, FL) otomatik, tek başına çalışan Micro 21 adlı mikroskobu piyasaya sundu. Şu ana kadar sadece lökosit alt tipi sayımı yapan cihazlar Gıda ve İlaç Kurumu’nun (FDA) onayını aldı. Başka mikroskoplu prosedürler de (retikülosit sayımı, vücut sıvıları, AFB’ler, DNA probları) planlanmaktadır. “Neural Vision” IMI’ patentli nöral ağ ve görüntü işlemcisidir. Ölçülen veya saptanan hücre özellikleri patern tanıma metodolojisiyle analog gibi görünmektedir.

 

3.5.17.2. Çok-Kanallı Cihazlar (Akışlı Sistemler)

 

Akışlı sistemler lökosit alt tip sayımı gerçekleştirmek için çok sayıda lökosit sayarak  hücreleri, hücre büyüklüğü, karmaşıklığı veya boyanma özelliklerine göre tanımlayarak analiz eder. Çok kanallı cihaz  yöntemleri aşağıda belirtilmiştir.

 

3.5.17.2.1. Lökosit Tayinini Hem Hücrenin Büyüklüğüne Hem De Sitokimyasal Boyama Tekniklerine Göre Yapan Sistemler

 

Hücrelerin miyeloperoksidaz boyama özelliklerini kullanan sistemler; kan örneklerini, eritrositleri parçalayarak ve lökositleri fikse ederek hücreleri sürekli akış sitometrik  yoluyla sayar. Bu sistemler Technicon H6000, H*1, H*2, H*3 serisidir(261). Hücreler bir dilüentle süspanse edilir ve parlak alan dedektöründeki  bir akış odacığından geçirilerek miyeloperoksidaz boyanın sitokimyasal özelliklerine ve analiz edilen her bir hücrenin hücre büyüklüğüne göre  analiz edilirler(63).

  1. Veriler hücre büyüklüğü (ışık saçınımı) y ekseninde ve miyeloperoksidaz boyama yoğunluğu veya aktivitesi x ekseninde olacak şekilde bir saçınım grafiğinde işaretlenir. Grafik nötrofiller, lenfositler, monositler, eozinofiller, bazofiller ve boyanmamış büyük hücreler gibi lökosit alt tiplerini gösterir.
  2. Toplam lökosit sayısı ve nötrofil, lenfosit, monosit ve eozinofillerin sayısı miyeloperoksidaz kanalında sayılır.
  3. Lenfositler küçük (düşük saçınımlı) hücreler şeklinde tanımlanır.
  4. Daha büyük atipik lenfositler, blastlar veya dolaşımdaki plazma hücreleri büyük, boyanmamış hücre kanalına düşer.
  5. Nötrofiller güçlü peroksidaz boyanma gösterir ve daha büyük hücreler şeklinde görülür.
  6. Eozinofiller çok güçlü peroksidaz boyanma gösterirler ancak ışık saçınımlarının bir kısmını abzorbe ettiklerinden nötrofillere göre daha küçük görünürler.
  7. Monositlerin peroksidaz aktivitesi daha düşük düzeydedir ve genellikle nötrofiller ile büyük, boyanmamış hücre alanları arasında saptanır.
  8. Sistem nötrofil alanını sınırlamak için değişken miyeloperoksidaz eşik değerleri kullanır ve bu eşik değerler miyeloperoksidaz boyanması bakımından örnekler arasındaki farklar için düzeltme yapılmasını sağlar.

 

Otomatik akışlı sistemler ile bazofilleri sayan modeller (Technicon H*1, H*2, H*3 serisi)  bazofil nükleer lobularite kanalını kullanır. Bu tayin için eritrositler  ve lökositler ayrı ayrı lizise uğratılır ve geriye lizise dayanıklı olan ve daha sonra hücre büyüklüğüne göre sayılan bazofiller dışında çıplak lökosit çekirdekleri kalır. Lökosit çekirdeklerinden elde edilen ışık saçınım verileri, olgun lenfosit çekirdeklerine göre daha düşük ışık saçınımı gösteren blastların belirlenmesine de yardımcı olur. Nükleer lobularite (çekirdek lobları) indeksi mononükleer ve polinükleer hücrelerin sayısına ait bir ölçüttür ve ortalama peroksidaz aktivitesi ve hücre sayısı verileriyle ilişki kurularak, olgunlaşmamış nötrofillerin veya çekirdekli eritrositlerin saptanmasına yardımcı olabilir. Bu anormal hücre popülasyonları cihaz tarafından işaretlenir ve periferik yaymanın morfolojik gözden geçirmesini gerektirir. Bu sistemlerin kullanıldığı çalışmalar akut lösemiler, miyelodisplastik sendromlar  ve akut enfeksiyon veya enflamasyonu tanımlama becerisinin iyi olduğunu göstermiştir(262-265). Bu tekniği kullanan analizler her örnek için binlerce hücreyi inceler ve bu istatistiksel doğruluğu arttırır. Bu yöntemi kullanan cihazlar aşağıda belirtilmiştir.

 

 3.5.17.2.1. Bayer-Technicon Kan Sayım Sistemleri

 

3.5.17.2.1.1. H*1/H*2/H*3

 

H*1 cihazı tezgah üstü oldukça küçük tek örnekli bir analizördür. Bu cihaz saatte 80 CBC ve trombosit sayımı yapar. Technicon H*2 cihazı saatte 100 CBC ve lökosit alt tip tayini yapar ve H*1 e göre daha hızlıdır. H*3 saatte 100 örnek ile otomatik retikülosit analizi yapar. Technicon sistemleri  48 saat önce alınmış eski kan örneklerinde bile doğru sonuçlar verdiğini iddia etmektedir.

H*1 peroksidaz analizi için bir tungsten halojen ışık kaynağına ve sitometreye sahiptir. Bu sitokimyasal reaksiyon için gereken süre 75 °C’ye ısıtma yapılarak azaltılır. Analizörün bilgisayarı katı saçınım ve abzorpsiyon eşik değerleri yerine, ayrı hücre tiplerinin toplu analizini gerçekleştirir. Her örnek için nötrofil boyama yoğunluğunun bir ölçütü olan ortalama peroksidaz indeksini(MPXI; referans aralığı -1 ila +10) de belirlenir. Bu indeks konjenital veya edinsel miyeloperoksidaz eksikliği olan hastaların saptanmasını sağlar(266). Lökositler ayrı bir kanalda(bazofil/lobularite) helyum-neon kırmızı lazer ışık kaynağı ile birlikte küçük ve büyük açılı saçınımlı dedektörler kullanılarak analiz edilir. Bazofil/lobularite kanalında, sürfaktan ve ftalik asit içeren bir seyreltici eritrositleri parçalar ve bazofiller haricindeki tüm hücrelerin sitoplazmasını uzaklaştırır(267). Y ekseninde küçük açılı öne saçınım dedektöründen alınan sinyal gösterilir. Sitoplazmalarını koruduklarından ve dolayısıyla yatay eşiği geçtiklerinden bazofiller sayılır. X ekseninde daha büyük açılı dedektör sinyali işaretlenir. Bu sinyal geri kalan çekirdeklerin şekil ve yapısından(dansite) etkilenir. Mononükleer hücreler sola düşer ve yapılandırılmış veya lobullü çekirdekleri olan hücreler ise sağa düşer; bunlar dikey bir eşik ile ayrılır. Blastlar genellikle en sağa kayarlar; x ekseninde sağa doğru gidildikçe lenfositler ve monositler varsa olgunlaşmamış granülositler mononükleer bölgede yer alır, bandlar, eozinofiller, nötrofiller ve çekirdekli eritrositler ile karşılaşılır. Peroksidaz ve bazofil/lobularite kanallarının sonuçlarının karşılaştırılması ve birleştirilmesi blastlar, atipik lenfositler, olgunlaşmamış granülositler, sola kayma ve NRBC’ler için spesifik işaretlerin verilmesini sağlar(73, 268).  

H2 cihazında bazofil/lobularite kanalında total lökosit sayısı da belirlenir ve peroksidaz kanalı WBC sayımının doğrulanması olarak kullanılır. H-6000 peroksidaz kanalında  total ve lökosit alt tipi sayımları ile  bazen anormal hemoglobinlerin saptanmasını sağlar(örn., Hb C, S, E, D). RBC/trombosit verileri bazofil/lobularite kanalının lazere dayalı optik sisteminin kullanılmasıyla elde edilir. Eritrositler kürelere (volümde değişme olmaz) dönüştürülür ve glutaraldehit ile hafifçe fikse edilir. RBC’ler küresel hale geldiğinde küçük açılı saçınım RBC büyüklüğünün bir fonksiyonudur; buradan MCV, RDW ve anizositoz, mikrositoz ve makrositoz işaretleri belirlenebilir. Yüksek açılı saçınım esas olarak RBC dansitesiyle (hücre başına düşen hemoglobin konsantrasyonu) belirlenir. Bu, kromazi (anizokromi), hipokromi ve hiperkromideki farklılıkları (VAR) işaretler ile gösterilmesine izin verir. Hücre volümüne karşı frekans histogramları ve hemoglobin konsantrasyonuna karşı frekans histogramları oluşturulabilir. Bu histogramlar küçük oranlarda bulunan anormal eritroid popülasyonlarının saptanmasını sağlar. H*1’in klinikte kullanımı ile ilgili bilgiler aşağıda belirtilmiştir(269-272).

  • Hemoglobin konsantrasyon verilerinden hemoglobin dağılım genişliği(HDW) de hesaplanır. Artmış HDW değerleri orak hücreli anemide yararlı bir parametredir.
  • H*1 eritrogram paterni talasemi taramasında faydalı bir parametredir.
  • H*1’deki yüksek nötrofil miyeloperoksidaz aktivitesi (MPXI) megaloblastik anemide yararalı bir göstergedir.(Özellikle MCV değerleri 100 fl’nin altında olduğunda)
  • H*1 ile hemoglobin konsantrasyon histogramı ile herediter splenocytosis’da hiperkromik mikrositik eritrositlerin yüksek oranını göstermede çok iyi olduğu ve splenektomi yapılmamış hastalarda ise bu oranda çok daha belirgin bir artış olduğu gösterilebilir.

 

3.5.17.2.2. Elektriksel İmpedans ve Işık Saçınım Özelliklerine     Göre Ölçüm Yapan Sistemler

 

Elektriksel impedans ve ışık saçınım özelliklerine  göre ölçüm yapan sistemler; lökosit alt tiplerinin sayımında kullanımlarının yanısıra, büyük hücre popülasyonlarını analiz edebilmeleri nedeniyle her hücre tipinin sayısını tekrarlanabilir ve doğru şekilde verebilirler.Bu sistemlerin prensibi hücre karmaşıklığına ve hücre volümüne dayanır(63, 273-274).

Bu tip cihazlarda lökosit alt tip(differantial) sayımı ve lökosit volüm tayinininde kullanılan elektriksel impedans yöntemiyle veya bu yöntemle ışık saçınım ölçümlerini birleştiren yöntemle yapılır. Başlangıçta bu yöntemle sadece nötrofiller, monositler ve lenfositler sayılabiliyordu. Bunun örneği Coulter S-Plus analizör serisidir(273-276). Bu yöntem lökosit lizisinden sonra çekirdek etrafındaki hücre sitoplazması ve sitoplazmik granüllerin yıkılmasını esas alır. Hücreler üç ayrı büyüklükte popülasyona ayrılır; büyük hücreler (nötrofiller), ara hücreler (monositler) ve küçük hücreler (lenfositler). Bu tip cihazlar büyüklüğü kesin olarak belirlenemeyen popülasyonlar olduğunda periferik yayma yapılması gerektiğini belirten bir işaret vermektedir. Bu tip teknoloji en iyi nötrofillerin ve lenfositlerin sayımında yararlıdır. Ayrıca, eozinofiller, bazofiller, atipik lenfositler, blastlar, olgunlaşmamış granülositler ve plazma hücreleri gibi diğer hücre popülasyonları monositik bölgeye veya granülosit bölgesine girme eğilimi gösterirler. Bundan dolayı bu verilerin yorumlanması zorlaşmaktadır. İncelenen  normal veya anormal hasta popülasyonuna bağlı olarak yalancı negatifliklerin oranı (gerçek anormal popülasyonun analizör tarafından saptanmadığı örnekler) % 4-16 arasındadır. Bu cihazlar genellikle tarama testi olarak kullanılırlar.

Bu elektriksel impedans ve ışık saçınım özelliklerine     göre ölçüm yapan sistemler  ve donanımlar daha yüksek hızla sayım yaparlar. Bu hematoloji analizörlerinin en yaygın kullanılanları aşağıda anlatılmıştır.

 

3.5.17.2.2.1. Coulter  Kan Sayım Sistemleri

 

3.5.17.2.2.1.1. Coulter Prensibi

 

İçerisinden akım geçirilen bir açıklıktan geçen hücreler elektriksel dirençte değişikliklere neden olur ve voltaj pulsları olarak sayılırlar(17, 171, 277). Bu prensip Coulter (MAXM, STKS, GEN.S vs.; Beckman Coulter, Inc. Brea., Ca), TOA (Sysmex , NE-8000, SE-9000 vs.; TOA Medical Electronics, Los Alamitos, CA), Abbott (Cell-Dyn 3500, 3700, 4000 vs.; Abbott Diagnostics, Abbott Park, IL), ABX (Micros 60, Pentra 60, Pentra 120, Pentra 120 Retic vs.; ABX Diagnostics, Inc. Irvine, CA) ve diğer firmaların ürettikleri cihazlarda kullanılmaktadır. Hücre şeklini koruyan izotonik iletken bir solüsyon (Isoton gibi) içerisinde kanın doğru şekilde seyreltilen bir süspansiyonu hazırlanır. Cihaz iletken sıvı ile doldurulabilen cam bir silindire (GC) sahiptir ve içerisinde bir elektrod (E2) ve duvarında 100 mm çapında bir açıklık (apertür) (A) bulunur. Cam silindirin hemen dışında başka bir elektrod (E3) bulunur. Silindir kısmen cıva (M) ile dolu olan ve iki elektriksel temas noktası (EC1 ve EC2) bulunan U şeklinde cam bir tübe bağlıdır. Cam silindir sayılacak olan hücre süspansiyonu içerisine daldırılır, iletken solüsyon ile doldurulur ve bir valf (V) ile kapatılır. Böylece E1 ve E2 arasındaki açıklıktan akım geçer. Cıva tüpte yukarıya doğru gittikçe, hücre süspansiyonu silindirdeki açıklığa doğru çekilir. Açıklıktan geçen her hücre eşit hacimde iletken sıvının yerini alır ve böylece direnci iletken solüsyonun direncinden çok daha fazla olduğundan elektriksel direnci arttırarak bir voltaj pulsu oluşturur. Hücrelerin hacmiyle yükseklikle doğru orantılı olan pulslar sayılır. Buna Coulter prensibi adı verilir(Şekil 68).

En basit sistemde sayma mekanizması cıva EC1 ile temas ettiğinde başlar ve EC2 ile temas ettiğinde durur. Bu süre içerisinde EC1 ve EC2 temas telleri arasındaki cam borunun hacmine eşit süspansiyon hacmindeki hücreler sayılır. Aynı anda iki veya daha fazla hücre açıklıktan girerse tek puls olarak sayılırlar; bu durum eşzamanlılık hatasına yol açar. Şu anda analizörler bu tip hataları otomatik olarak düzeltebilmektedir. Eşik ayarı veya puls ayırt edicisi belirli sayaçlarda ayarlanabilir yüksekliğin altındaki pulsların dışlanmasını sağlar. Diğerlerinde ikinci bir eşik belirli bir yüksekliğin üzerindekipulsların sayımını dışlar. Dolayısıyla iki durum arasında sadece penceredeki hücreler sayılır. Her bir eşiğin belirli artışlar ile sistematik olarak değiştirilmesiyle relatif hücre hacimlerinin frekans dağılımı belirlenebilir. Bu tip hücre büyüklük dağılımları otomatik olarak grafiğe işlenebilir ve iki veya daha fazla değişen hücre popülasyonu bulunduğunda eritrositler, lökositler veya trombositlerin analizinde değer taşır. Bu, kan hücre histogramlarının tayininde temel oluşturur ve şu anda çok-kanallı hematoloji analizörlerinde rutin olarak kullanılmaktadır.

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 68. Coulter Prensibi

 

 

 

 

1960’ların başlarında geliştirilen elektriksel impedans prensibini ilk kez Coulter analizörleri kullanmıştır(278). Çoğu cihazda tam kan doğrudan aspire edilir ve hücrelerin büyüklüğünü koruyan ve elektrik iletken isoton içerisinde mekanik yolla seyreltilir. Eritrosit ve trombosit ölçümlerini yapmak için bir dilüsyon kullanılır. Başka bir dilüsyonda eritrositler parçalanır ve hemoglobin hemoglobinsiyanide dönüştürülür. Bu süspansiyondan hemoglobin konsantrasyonu yaklaşık 530 nm’de kolorimetrik yolla ölçülür ve lökosit parametreleri belirlenir. Eritrosit ve lökosit hücre sayıları elektrikal rezistans ve puls voltaj prensibine dayanarak üçer kez belirlenir. Bir sonuç diğer ikisinden önceden belirlenen miktardan daha fazla farklı olmadıkça üç apertür tayininin ortalaması alınır; bu durumda uyumsuz sonuç dışlanır ve diğer ikisinin ortalaması yazdırılır. Üç sonucun hepsi uyumsuz ise, hiçbiri kabul edilmez (“vote out”= red) ve hiçbir değer yazdırılmaz. MCV ve eritrosit dağılım genişliği (RDW) RBC histogramından belirlenir. Hematokrit MCV’nin eritrosit sayısı ile çarpılmasıyla elde edilir. Diğer göstergeler (MCH, MCHC) hesaplanır. Kan Hücre Histogramları; RBC’ler ve trombositler için histogramlarda x aksisine  hücre büyüklüğü(fl), y aksisine ise hücrelerin mutlak sayısı işaretlenerek histogramlar türetilir(Şekil 69). Ortalama hücre ve yayılma büyüklüğünün tayininde ve alt popülasyonların saptanmasında kullanılır. Dağılımlar katod ışın tübünde sayısal veriler ile birlikte gösterilebilir ve yazdırılabilir(41).  Histogramların inclenmesi kalite kontrol aracı olarak  incelenebilir. Tablo 29-30’ da trombosit ve eritrosit histogramlarının özellikleri belirtilmiştir.  Histogramlar incelendiğindesiyah çizgi normal hücre dağılımını göstermektedir. Kırmızı çizgi eritrositler ve trombosit histogramı üzerinde ise çok mikrositik eritrositlerin  etkisini göstermektedir. Birçok histogramlarda kırmızı çizgi, siyah çizginin üstünde gösterilir.

 

 
 

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

          

 

 

 

 

 

 

 

 

 

           
   

 

 
 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

      

 

 

 

 

       
   
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 69. Histogramlar. A.Normal PLT ve RBC histogramı B.Küçük eritrositler ve dev trombositlerin   histogram üzerinde gösterilişi.

 

 

Tablo 29. Trombosit Histogramının Özellikleri (Kalite Kontrol Aracı Olarak Kullanılması)

                             

Göstergeler

 

Muhtemel nedeni

 Yorum

Histogramın sola doğru pik yapması(2-8 fl)

 

Sitoplazmik fragmentler

Periferik yayma yapılır

Histogramın sağa doğru pik yapması

Şiştosit, mikrosit ve dev trombositler

Periferik yayma yapılır.

CBC kontrolü yapılır.

(MCV↓&RDV↑,MPV↑& PDV↑)

 

Bimodal pik

Sitoplazmik fragmentler

Periferik yayma yapılır.

 

VerilerHematology in the Physician Office Laboratory Section I, Kathleen Kelly B.S., MT(ASCP), Iowa Üniversitesi, alınmıştır.

Tablo 30. RBC Histogramının Özellikleri (Kalite Kontrol Aracı Olarak Kullanılması)

 

Göstergeler

Olası nedenler

Yorum

 

Eğrinin sol kenarının alt çizgiye değmesi

Şistosistler ve çok kücük eritrositler

Periferik yayma yapılır

CBC ve PLT histogramını kontrol et

 

Bimodal pik

Transfüze edilen  hücreler

Tedaviye cevap

 

Perferik yayma yapılır

Eğrinin sağ bölümünün uzaması

 

Eritrosit otoaglütinasyonu

Periferik yayma ve CBC yapılır.

Eğrinin sağa kayması

mikrositler

Periferik yayma ve CBC yapılır.

 

Eğrinin sola  kayması

Makrositler

Periferik yayma ve CBC yapılır

 

VerilerHematology in the Physician Office Laboratory Section I, Kathleen Kelly B.S., MT(ASCP), Iowa Üniversitesi, alınmıştır.

 

 

 

3.5.17.2.2.1.1.1. Coulter STKS ve Gen-S

 

Coulter STKS ve Gen-S volümü ölçmek için elektriksel impedansı, iletkenliği ölçmek için yüksek frekanslı elektromanyetik alanları ve hücre sitoplazmasının karmaşıklığını veya granül içeriğini belirlemek için monokromatik lazeri kullanır. Bu cihazlar saatte 144 örnek analiz edebilir. Bu cihazlar lökositleri nötrofiller, lenfositler, monositler, eozinofiller ve bazofillere ayırabilen üç boyutlu saçınım grafiği oluştururlar ve anormal popülasyonları işaretlerler(279-284).

COULTER STKS Akış sitometrisine dayalı bu model eşzamanlı volümetrik impedans ölçümlerini (V), yüksek frekanslı elektromanyetik hücre problamasından elde edilen hücre iletkenliği (C) ve lazer ışık kaynağından (S) elde edilen saçınım ile birleştiren VCS teknolojisini kullanır. WBC’ler elektrooptik akış hücresinde orijinale yakın durumlarında analiz edilir. Tipik olarak 8000’in üzerinde WBC analiz edilir veya 20 saniye sayılır (hangisi önceyse). Hücre volümü klasik Coulter impedans prensibi ile belirlenir. İletkenlik hücrelerin iç bileşenleri (kimyasal bileşim, nükleus özellikleri ve granül içeriği) hakkında bilgi veren yüksek frekanslı elektromanyetik bir prob kullanılarak belirlenir. İletkenlik küçük lenfositler ve bazofiller gibi büyüklükleri yakın hücrelerin ayırt edilmesinde özellikle önemlidir. Helyum-neon lazer ile oluşturulan monokromatik ışığın öne açılı saçınımı hücre yüzey özelliklerini, morfolojisini ve granülleri belirler. Lazer ışık saçınımı (DF1) eozinofiller gibi granüllü hücrelerin tanınmasında özellikle önemlidir. Her hücrenin grafikte VCS ölçümlerine göre işaretlenmesiyle her hücre üç boyutlu grid üzerinde karakteristik lökosit kümesine yerleştirilir. Saçınım değerleri farklı popülasyon dansiteleri için renkli kodlar ile CRT’de gösterilir.

Gen.S cihazı retikülositleri otomatik olarak sayar. Hassasiyeti ve işaretlemeyi arttırmak ve lökosit alt tip sayımını gözden geçirme oranını azaltmak için geliştirilmiş algoritmalara ve yazılımlara sahiptir. Örnek hazırlama reaksiyon kinetikleri, reaktif reaksiyon sıcaklığı, maruz kalma süresi ve ortam koşullarına bağlı dağılım volümlerinde ayarlamalar yapılarak daha iyi kontrol edilir. Adaptif gate teknolojisi ile hücre tiplerinin üs üste örtüşen  hücre kümelerinin daha iyi ayrılması sağlanır. NRBC, nötrofil (NE) blastı, lenfosit (LE) blastı, monosit(MO) blastı ve varyant lenfositler için kuşku işaretleri verilir. Gen.S  cihazına opsiyonel olarak otomatik lam hazırlayıcısı(slide maker) entegre edilebilir.

 

13.5.17.2.2.1.1.1.2. Coulter LH 750

 

LH 750 kan sayım cihazı, klinik laboratuarlarda az zamanda çok iş yapılmasını sağlayan, kullanımı kolay, güvenilir ve saatte 110 örneği analiz eden bir sistemdir(285). Her bir örnekte CBC ve NRBC sayımı, retikülosit sayımı ve 5 tip lökosit alt tipi sayımı, anormal flag ve lökosit sayımlarında  interfere edici maddeleri elimine ederek doğrulanmış lökosit sayımı yapan tam otomatik bir hematoloji analizörüdür. Tam otomatik random acces fonksiyonu sayesinde aynı anda pek çok parametrenin analizini gerçekleştirebilir. Bu özelliği sayesinde aynı anda  sadece CBC, CBC ile beraber Differential, retikülosit veya 3 mod beraber (CBC+CBC Diff + CBC Diff Retic + CBC Retik + Retik) çalışabilir. Ayrıca kemik iliği ve vücüt sıvılarında(CSF, pleural, peritonal, perikardiyal veya sinovial sıvıları) RBC, diff ve nRBC sayımını doğru şekilde analiz eder.

Bu analizör volüm,iletkenlik ve saçınım teknolojisi ile lökosit ve lökosit alt tiplerini, trombosit ve anormal hücrelerin tanımlayan flag işaretlerini ve NRBC sayımını bu teknikle sayar. Coulter VCS teknolojisinin 3 boyutlu özelliği ile her hücre hacim, ışık saçılım ve iletkenlik özelliklerine göre ayrı ayrı ve ayrıntılı olarak analiz edilmektedir. Hidrodinamik odaklama ile kuartz flow cell içinde hızla ve tek tek hücre analizi gerçekleştirilmektedir. Gerçek üç boyutlu hacim ölçümü sırasında, hücreler elektriksel dirençlerindeki değişimlere göre sayılmaktdır. Bu radyofrekans enerji kaynağı kullanılarak her hücre için iletkenlik analizi yapılmaktadır. 1 ile 70 arasında değişen çok açılı ışık saçınım özelliklerine göre hücreler büyüklük, granülarite, yüzey biçimi, ve yansıma özelliklerine göre değerlendirilmektedir. Tüm bu hücreler, 8000’in üzeri hücrede ve her hücre için aynı anda analiz edilmektedir. Böylece hücre karakteristikleri ile anormalliklerin kesin ve hassas tayinleri gerçekleşmektedir. LH 750 cihazında WBC, RBC VE Plt sayımlarında AccuCount teknolojisi kullanılmaktadır. Sitopenik örneklerde(WBC, RBC,Plt ) analiz süresi otomatik uzatilamaktadır ve MCV’yi direkt ölçmektedir.WBC linearitesi 400.000 trombosit için ise 3.000.000 kadar lineerdir. LH 750 analizörü süper teknolojik donatıma sahiptir. nRBC sayımı ve random access özelliği ile yüksek kapasiteli laboratuaralar için örneklerin analiz öncesi işlemlerini eliöminde eder vekliniğe sonuçlar çok hızlı ulaşır.bu sistemin test accurasısı oldukça yüksek ve hala gelişmeye devam etmektedir. Accu-Count teknolojisi endüstri teknolojisinde devrim yaratan bir tekniktir. Coulter prensibini doğruluk, kesinlik ve linearite gibi geniş kapsamlı ilerlemiş algoritmalarla güçlendirerek birleştitirir. Bu teknoloji yalancı pozitif işaretleri azaltarak, örnek tekrarlama, örnek dilüsyon işlemleri ve periferik yayma yapma, manuel lökosit düzeltme gibi operatör gerektiren işlemleri elimine ederek test yöntemlerinin verimliliğini arttrırır. Bu cihaz yüksek kapasiteli laboratuarlar için uygundur.

 

3.5.17.2.2.2. Sysmex  Kan Sayım Sistemleri

 

3.5.17.2.2.2.1. Sysmex NE-8000

 

Sysmex NE-8000 saatte yaklaşık 120 örnek analiz edebilir. Bu cihaz WBC’leri granülosit, lenfosit ve monosit kategorilerine yerleştirmek için doğru akım elektriksel impedansına ve radyo frekans iletkenliğine sahip hidrodinamik olarak odaklanan bir akış sitometresi kullanır. Sysmex NE-8000 monositleri, nötrofilleri ve lenfositleri belirlemek için elektriksel impedansı ve elektromanyetik verileri kullanır ve daha sonra  bir lizis ajanı ile eozinofilleri ve bazofilleri tanımlar. Eozinofiller ve bazofiller diğer hücre tiplerinin lizisinden veya küçültülmelerinden sonra impedans büyüklük ölçümü kullanılarak iki ayrı kanalda selektif biçimde sayılır. Nötrofiller ayrı ölçülen eozinofiller + bazofillerin toplamı toplam granülosit sayısından çıkartılarak hesaplanır(286-287).

NE-8000 beş tip lökosit popülasyonun kabul edilebilir ayrı sayımlarını da verir ve diagnostik kullanım açısından güvenli ve etkin olduğu kabul edilir .

 

3.5.17.2.2.2.2. Sysmex SE-9000

 

Sysmex SE-9000’nin prensibi Sysmex NE-8000 ile aynıdır sadece blast ve olgunlaşmamış miyeloid hücreler hakkında ek bilgiler veren olgunlaşmamış hücre kanalı eklenmiştir. Bu kanal WBC işaretlerinin spesifiklik ve doğruluğunu arttırır ve işaretleme derecesinin kantitatif olarak gözden geçirilmesini sağlar(288).

 

3.5.17.2.2.2.3. Sysmex XT

 

Sysmex XT-2000 i  cihazı  saatte 80 numunenin analizini yapana küçük kapasiteli laboratuarlar için uygun bir cihazdır. 5 tip lökosit formülü ve retikülosit sayısını tam otomatik ölçen bir analizördür. WBC flow sitometrik, RBC ve PLT impedans direkt akım tayiniyle, hematokrit RBC pulse-height tayin metodu ile, retikülositler nükleik asit boyalar kullanılarak  flow sitometrik metodla, MCV ve diğer eritrosit parametreleri(MCH, MCHC, RDW, MPV gibi) ölçülen parametrelerden hesaplanarak ölçülmektedir(198).

 

3.5.17.2.2.2.4. Sysmex XE- 2100

 

Sysmex XE-2100 cihazı, tam otomatik rastgele seçimli(random Access) ve saatte 150 numunenin analizini yapma kapasitesine sahiptir. Lökosit alt tipleri, anormal flaglar ve otomatik retikülosit ölçen tam otomatik bir analizördür. CBC/retik modunda otomatik retikülosit sayımı yapabilir bu mod açık olduğu zaman lökosit sayımlarında otomatik düzeltme yapabilir. Lökosit sayımı ve anormal flag işaretlerini litik ajanlar kullanarak flow sitometrik olarak ölçer. NRBC sayımı hem spesifik litik ajanlar hemde floresan boyalar kullanılarak yapılır. Sysmex XE-2100 cihazında nRBC sayımı otomatik ölçülmektedir(216).

            Bu cihaz numune analizini yaparken farklı metodlar ve teknolojiler kullanır. Floresans flow sitometri metod ile lökosit, lökosit alt tipleri ve olgunlaşmamış hücreler, retikülosit ve retikülosit alt parametreleri ve Plt(O) ölçülür. Flow deteksiyon metodu ile RBC+Plt+Hct parametreleri, SLS Hemoglobin metodu ile hemoglobin ölçümü yapılır. Sysmex XE-2100  cihazıayrıca olgunlaşmamış hücre (Immature granulocyte cell) ve kök hücre bilgilerini,  IMI Scattergram olarak verme özelliğine sahiptir. Sysmex XE-2100 cihazı, parametrelerinin ölçümünü “Absolute Measurement”(gerçek ölçüm) esasına göre yapar. Sysmex XE-2100 cihazına opsiyonel olarak otomatik lam hazırlayıcısı(slide maker) ve lam boyama modülü(slide stainer) entegre edilebilir8289-290).

Sysmex XE-2100 cihazında ayrıca retiküllü trombositler (olgunlaşmamış trombosit fraksiyonu(IPF) ve retikülosit hemoglobin eşdeğeri (RET-He) ölçülmektedir. IPF trombopoezin indexi olarak da ifade edilir. IPF, iliğin trombopoetik aktivitesi ile ilişkili olan trombosit populasyonunun en küçük olgun bileşenlerini ölçer. IPF, trombositopeninin orjininin kemik iliği yetmezliğinde mi yoksa  periferik trombosit tüketiminden veya yıkımından ayırmada yardımcı olan bir testtir(290). Trombosit üretim hızının hızlı bir göstergesi olan IPF % olarak ifade edilir. IPF ve RET- He Master software’ini kullanarak Sysmex XE-2100 cihazında ölçülür. RET-He ortalama retikülosit içeriğini pikogram düzeyinde direkt olarak ölçümünü sağlar. Bu cihazda ayrıca FDA onaylı hematopoetik progenitör hücre(HPC) parametresi ölçülmektedir(291). Bu G-CSF tedavisi olan hastaların monitorizasyonunda hızlı ve ekonomik bir parametredir.

 

 3.5.17.2.2.3.  Cell-Dyn Kan Sayım Sistemleri

 

3.5.17.2.2.3.1. Cell-Dyn 3000

 

Cell-Dyn 3000 tüm lökosit alt tiplerini ışık saçınım özelliklerine göre belirler (küçük açılı ileri ışık saçınımı, geniş açılı ışık saçınımı, ortogonal ışık saçınımı ve depolarize ışık saçınımı)(292). Cell-Dyn 3000 lökosit alt tiplerini saymak için Çoklu Açılı Polarize Saçınım Ayrımı(MAPSS) adı verilen teknolojiyi kullanan çok-parametreli bir hematoloji analizörüdür(50, 293). Lazer ışını geniş bir profil içerisinde şekillendirilir ve kuartz akış hücresine odaklanır. Bu hüzme şekli lazer hizalamasını diğer akış sitometrelerinden daha az kritik hale getirir. Kan lökositleri orijinaline yakın durumda koruyan ancak eritrositleri lazerde transparan hale getiren bir solüsyonda seyreltilir. Her lökosit için dört eşzamanlı ışık saçınım ölçümü yapılır. Sıfır derece öne açı esas olarak hücre büyüklüğü ile belirlenir. 10 dereceli ışık saçınımı, hücre yapısının ve karmaşıklığının bir göstergesidir ve bazofillerin tanımlanmasında ve tüm hücre popülasyonlarının ayrılmasında özellikle yararlıdır. 90 derece ışık saçınımı granüllü hücreleri ayırır ve lobularite olarak adlandırılır. Depolarize 90 derece ışık saçınımı büyük kristalimsi granüler yapılarına bağlı olarak eozinofilleri ayırır. Anormal hücreler büyüklüğe karşı karmaşıklık saçınım grafiklerinde özgün bölgelerde bulunur ve blastlar, varyant lenfositler, bantlar ve olgunlaşmamış granülositler gibi lökosit kuşku işaretlerinin belirlenmesine yardımcı olur.

 

3.5.17.2.2.3.2. Cell-Dyn 3500

 

Cell-Dyn 3500 küçük ve sessiz çalışan bir cihazdır. Cell-Dyn 3500, 0, 10 ve 90 derecelik açılarda hem impedans hem de lazer ışık saçınımını kullanır. Rutin WBC sayımı apertür impedans analizine dayanır ve WBC’nin doğrulanması için lazer optik kanalı kullanılır(294). Genişletilmiş lizis modu” yenidoğan örneklerinde yaygın bir durum olan lizise dirençli eritrositlerin enterferansını önleyen benzersiz bir özelliktir. İmpedans apertürü özgün bir von Behrens levhasına sahiptir ve bu levha RBC/PLT’in açıklıktan geçtikten sonra hücrelerin sensör bölgeye tekrar girmelerini önler.

 

3.5.17.2.2.3.3. Cell-Dyn 4000 ve Cell-Dyn Saphire

 

 Abbott’un en son hematoloji analizörü Cell-Dyn 4000 birçok özgün ek özelliğe sahiptir. Otomatik rastgele seçimli analizördür. Cell-Dyn, basit kalibrasyon işlemleri  gerektiren ve kullanımı basit ve FDA onaylı bir cihazdır(218, 295). Monoklonal antikor testleri tam otomatik olarak yapılmaktadır. Bu cihaz oldukça ekonomiktir ve temel özellikleri nedeniyle klinik yararı oldukça önemlidir. Retikülositlerin floresan tayini tam otomatik,  rastgele seçimlidir ve nRBC floresan DNA boyanması lökositlerin kesin ve doğru sayımını sağlar ve nRBC sonuçları rapor edilebilir. Trombostiler hem optikal hemde empedans metodu ile ölçülür. Argon-iyon-lase ışık saçınım ölçüm yöntemi (MAPPS teknolojisi ) ve sabit –akımlı impedans, iki renkli flow sitometri ile kombine olması temel özelliklerini oluşturur. Üst modeli Cell-Dyn Saphire  basit , otomatik, basıt kullanımlı ve basit kalibrasyon işlemleri olan bir cihazdır(206 ) Gelecekte hematoloji analizöründe rutin monoklonal analizler yapan gerçek diagnostik bir cihaz olacaktır. 3 renkli floresans teknolojisi(MAPPS) ile hücre sayım  kesinliğini arttırır. Bu teknoloji; lökosit, lökosit alt tip sayımı, anormal hücrelerin, interefere edici maddelerin ve nRBC’lerin tanımlanmasında ilk basamaktır. Ayrıca trombosit kümeleşmesinin kesin olarak tanımlanmasında kullanılır ve lökosit alt tip sayımını  interfere eden çekirdekli eritrositler, kümeleşmiş trombositler ve debrisi uzaklaştırarak sonuçların güvenliğini arttırır.

İç dizaynı servis ve  bakımı minimize ederek güvenilirliği arttırır.Bu cihaz yüksek kapasitlei laboratuarlar için uygundur.

Total lökosit ve lokosit alt tip sayımınında rezistans eritrositleri güçlü litik metod kullanarak elimine eder. Rezistans RBCler varlığında rezistans RBC modunu kullanarak lökosit sayımları için manuel doğrulama ve periferik yayma gerekliliğini azaltır.

Bu sistemde retikülositler 3 renkli floresans flow sitometrik yöntemle otomatik olarak ölçülür. Bu yöntemle retikülosit populasyonundan lökositoz varlığında trombositler ve olgun eritrositler mükemmel ayırt edilir. Olgunlaşmamış retikülosit fraksiyonu da floresans metotla  ölçülür. Kırmızı floresans kullanılarak her örnekte nRBC otomatik olarak analiz edilmektedir. Ayrıca çekirdekli hücre alt populasyonların sayılmasıyla düzeltilmiş lökosit sayısı gerekliliği elimine edilir. Cell-Dyn Saphire cihazına opsiyonel olarak otomatik lam hazırlama(slide maker) ve lam boyama modülü(slide stainer) entegre edilebilir.

 

 

 

 

 

3.5.17.2.2. 4. Cobas Kan Sayım Sistemleri

 

Cobas Helios analizörü akış sitometrisi ve ışık saçınım teknolojisini kullanır ve diğer sistemlere göre bant nötrofillerini biraz daha iyi tayin eder. Doğruluk ve kesinliği diğer lökosit ve eritrosit parametreleri  ile benzerdir(296).

1980’lerin ortalarında ABX, Roche Diagnostics firmasına aitti ve Cobas adı altında bu firma tarafından dağıtılıyordu. 1996’da ABX ile birlikte Horiba (partikül sayım cihazlarının önde gelen Japon üreticisi) ABX’i satın aldı. Üretimdeki güncel ürünler PENTRA 60 (tam CBC, beş bölümlü diff ve saatte 60 örnekte 27 parametre), PENTRA 120 (29 parametre, saatte 120 örnek) ve PENTRA 120 RETIC’dir (12 retikülosit parametresi dahil 38 parametre, saatte 120 örnek ve PENTRA DX 120  (saatte 120 örnek, 45 parametre).

 

 3.5.17.2.2.4.1. ABX Sistemleri

 

Vega analizörü hücre analizi için sitokimyasal, impedans, absorbans ve flow cytome(hidrodinamik akış) tekniğini kullanır. WBC’ler, RBC’ler ve trombositler  elektriksel impedans tekniği ile ölçülür. Eosinofil reaktifi ile eozinofil granülleri boyanır ve çekirdekli hücreler fikse edilir. Bazofiller diğer lökositlerin basolyse reaktifi ile parçalanmasından sonra ayrı bir odacıkta elektriksel direnç ile tayin edilir(48,75).

Yeni sistem PENTRA DX 120 cihazı kan sayım hücrelerinin ölçümü için sitokimyasal, impedans, absorbans, flow sitometri ve florometri ölçüm teknolojisini kullanır. Flow sitometri ve sitokimyasal özellikleriyle beraber  double diff matrix teknolojisinin birleştirerek granülosit , lenfosit ve monositlerin  olgunlaşmamış formlarının(band) kantitatif olarak tanımlanmasını sağlar. Lökosit alt tip ve retikülosit sayımında fokuslanmış impedans ve absorbans teknolojisini birleştirerek(DHSS) önce flow sitometrik daha sonra seri ölçüm yapılır. Retikülosit sayımı için ileri saçınım(90 derece) lökosit sayımı için ise ışık transmisyonu özelliğini kullanır. Lökosit alt tip sayımı için önce lökositler stabilize edilir sadece eosinofiller boyanır. Her bir hücre sayımı  için 3 metot uygulanır. Bunlar  sitokimyasal, flow impedansı ve optik ölçüm tekniğidir. En son olarak matrisin tanımlanmasıyla hücreler tayin edilir. Büyük olgunlaşmamış hücreler ve atipik lenfositler yüzde ve mutlak sayı şeklinde verilir. Böylece manuel olarak incelenen periferik yayma azaltılmış olmaktadır. Pentra DX 120 cihazında  NRBC  direkt ölçülmekte ve lökosit sayımı için otomatik düzeltme yapılmaktadır. Bu modellerine slide maker ve slide stainer sistemleri entegre edilebilir. Pentra DF 120 cihazına opsiyonel olarak slide maker ve slide stainer mödülü entegre edilebilir.

 

3.5.17.2.2. 5. BAYER Kan Sayım Sistemleri

 

3.5.17.2.2.5.1. BAYER ADVIA 120

 

Bayer ADVIA 120, 24 saat çalışabilen, tam otomatik, sürekli seçmeli ve sürekli yüklemeli bir cihazdır. Saatte 120  CBC/Diff tayini yapar. Büyük, berrak bir plastik sıvı devre bloğunu içeren uni fluidics(UFC) teknolojisi, tubing sistemini en aza indirir. Bu sistem güvenirliği daha da arttırır. UFC sistemi ile hortumlardan kurtularak minimum bakım ve mikrolitre düzeyinde reaktif kullanabilme avantajı vardır. Tüm vucüt sıvılarında [(Plevra, Periton, Perikard, Beyin Omurilik Sıvısı(B.O.S)] ve kemik iliği aspirasyon sıvı analizleri FDA onaylıdır. Tüm hücrelerin sayımında laser ışık saçınım teknolojisini kullanır. Hücre morfolojisinin tayininde referans peroxidase ve oxasin 750 sitokimyasal boyalarını kullanır.

CBC parametrelerini unifludics, flowcell teknolojisi ve laser optik ölçüm teknolojisi ile hemoglobin düzeyini laser-optik ve kolorimetrik yöntemle, lökosit alt tip parametrelerini laser optik ve peroksidaz boyama metodu ile retikülosit parametrelerini ise laser optik  ve Oxacin 750 boyama metodu ile  ölçer. Lökositler eritrositlerin lizis edilmesinden sonra iki kanalda peroxidase ve basofil/lobularite kanlında  analiz edilerek sayılır. lökosit, lökosit alt tipleri ve boyanmamış büyük hücreler yüzde ve mutlak sayıları peroxidase kanalında yapılır. Ayrıca bu kanalda lökositlerin ortalama peroxidase aktivitesi ölçülür(297).

Bayer ADVIA 120’nin üst modeli 2120 cihazına opsiyonel olarak slide maker ve slide stainer mödülü entegre edilebilir.

 

3.5.18. Klinik Veteriner Hematoloji

 

            Tam kan sayımı veteiner tıbbi pratiğinde kullanılan rutin tanısal bir prosedürdür. CBC sayımlarına isteklerin artmasından dolayı birçok veteriner laboratuarı uzun zaman alan ve yoğun emek isteyen manuel hücre sayım metotlar yerine otomatik cihazları kullanmaya başlamıştır. İlk cihaz hücre sayılarını hızlı ve doğru sayan impedans teknolojisine dayanan teknolojidir. Ançak bu metot hücre morfolojisi hakkında detaylı bilgi vermemektedir. Son on yılda  impedans teknolojisindeki gelişmelerle yeni çeşitli hematolojik parametrelerle  sonuçlanmıştır. Ançak bu teknoloji sınırlı sayıda hücre morfolojisini değerlendirebilir.Çünkü birçok otomatik hematolojik analizör insan kanı analiz edecek şekilde geliştirildiğinden bu cihazların veteriner laboratuarlarına adaptasyonu için her bir hücre tipinin türlere göre değerlendirilmesi gerekir. Laser-metodu ile ölçüm yapan hematoloji analizörlerinde  hücre tiplerini türlere göre adaptasyonu için cihaz ayarlarını otomatik olarak ayarlayan software paketiyle başarıyla yapılabilir. Ançak her laboratuar her bir test tipi için sonuçların güvenirliğini ve doğruluğunu hem normal hemde anormal hastalığı olan hayvanlarda tayin etmelidir. Ançak bu büyük yatırım ister. Ayrıca hem hücre morfolojisinin ölçmek hemde kediler gibi bazı türlerin  referans değerlerinin tayinlerinde yeterli miktarda kan almak oldukça zor olduğundan  bu tür çalışmalar bu alanda çalışan insanların cesaretini kırmaktadır(298).

            Klinik veteriner pratiğinde hematoloji analizlerini yapmanın birçok avantajı vardır.bunlar;

  • Örnek toplanmasının kontrolu; analiz için kullanılan örneklerin elle doğru toplanması ve gerekrise yeniden örnek alabilme imkanı olmaktadır.
  • Taze örneklerin bulunabilinir olmasıyla örneklerin bozulmasından hatalı sonuçlardan kaçınılır.
  • Acil tanısal bilgiler  sağlar(tedavi ve sevk için belirtiler sağlayarak müşteriye  zamanında konsültasyon için bilgi verilir.

            Hematoloji analizleri tek başına birçok yararı vardır. Ayrıca uygun örnek toplanması ve cihaz bakımı gereklidir. Cihazların doğruluğunun kanıtlanması dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Tam kan sayımı, analizlerinde altın standart tekniği olarak tanımlanan manuel metotlar zahmetli ve doğru sonuçlar elde etmek için teknik yeterlilik ve uzmanlık gerektirir. Lökosit alt tiplerini saptamak hematolojik analizlerinde enzor görünmektedir. Manuel alt tip sayımlarında manuel yaymalarda hücre saymı sınırlıdır. Tipik olarak 100 hücre sayılır  ve binlerce hücre sayan otomatik cihazlarla karşılaştırılır. Yaymaların mikroskopik incelenmsi eğitimli kişiler tarafından bakıldığı için doğruluk seviyesi yüksek ve periferik yaymaların görünüşü klinikle ilişkisine bakıldığında subjektifliğinin derecesi çok geniş olacağından teşhis tutarlıdır. Örneğin bandların bulunması(olgunlaşmamış nötrofiller otomatik analizörlerde genellikle sıkılıkla monosit olarak tanımlanırlar, sağa veya sola kayma(nötrofiller), çekridekli eritrositler(otomatik sistemlerle eritrositler lizisini takiben lökosit olarak sayılırlar. Olgunlaşmamış ve patolojik hücreler(sıklıkla otoamatik sistemlerde yanlış kategorize edilirler), doğru eritrosit morfolojisi, trombosit yeterliliği gibi(özellikle dev ve aggerege trombosit populasyonları sıkılıkla  kedigil  örneklerinde görülür) durumlar

Endüstri ve uzmanlar özellikle durumu çok kötü olan hastalarda periferik yayma yapılarak mikroskopik olarak değerlendirilerek doğrulanmasını önermektedirler.

            Bügünlerde veteriner kliniklerinin çok yoğun olduğu için otomatik hematolojik cihazlar açıkça istenmektedir. Veteriner kanının az olmasından dolayı otomasyonda kullanılan metotların doğruluğunun yapılması gereklidir. Kalitatif spesifik kapiller tüplerinin(QBC,IDEXX laboratuarları) kullanımınıyla ilerleme kaydedilmiştir. Kan sayımında kullanılan kalitatif sistemler  ortalama hücre büyüklüğüne dayanmaktadır. Çünkü hücreler aslında sayılmaz, doktorlar bu cihaların sonuçlarının normal ve iyi hastalarda oldukça doğru olduğunu sanmaktadırlar. Ançak sonuçlar hastalarda tamamıyle geçersiz olabilir.

Otomatik hematolojide impedans ve laser flow sitometri doğruluğu ortaya koyulmuş iki iyi metottur. Gerçekten  bazı üreticiler her iki teknolojiyi bir sistemde etkili bir şekilde kullanmaktadırler (Advia 60 ve Cell Dyne 3500 sistemleri). Bu sistemler bügün veteriner kliniklerine göre geliştirilmiştir. İmpedans metot veya coulter metotu olarak adlandırılan mettot şöyledir.; elektrik olarak nötral olan kan hücreleri apertürden geçerken elektriksel bir pulse oluşturular. Hücre sayımı; kanın belli volümünün set edilen sürenin üzerinden ölçülen birçok sayıdaki pulsların sayısından tayin edilir. Elektriksel iletkenliğin azalışı ölçülen hücre volumuyle orantılıdır. Bu hücre ayrımı çeşitli lizis ajanlarıyla temel hücre tiplerininni (eritrosit, lökosit, ve trombosit) birbirinden ayırır. Düzgün şekilde kalibre edildiklerinde oldukça güvenilir hücre sayısı, hemoglobin ve indeks değerleri verirler. Lökositlerin doğruluğu  her bir sistemin dizaynına ve uygun algoritmalara bağlıdır. İmpedans teknolojisi hücreleri iki metoda göre sınıflar. Lizis ajanı ve kütle büyüklüğüne göre sınıflar. Lizis miktarı ve zamanlaması güvenilir ayrıntılı sayım elde edilmesinde önemli rol oynayan bir basamaktır. İmpedans sayıcısının performansı, hücrleri sınıflandırılması ve etkili bir şekilde ayıran   türlere spesifik algoritmaların geliştirilmesıyle yükseltilebilir.

Lazer motodu ise hücre sayımı, ışık saçınımı ile hücrelerin ayırt edilmesi  ve hücrelerin sınıflandırılmasında kullanılan flow sitometrik bir tekniktir. Bu yaklaşımla hücrenin içine bakma yeteneği olarak tanımlanır ve böylece hücresel yapının farklılaşması gösterilir. Çeşitli boyalar kullanılarak tanımlanan hücre tiplerini  hüsrelerin farklılaşmasında ve hücresel inklüzyonlarnı(retikülosit gibi)  tanımlanmasında yardımcı olur. Bu  teknoloji Bayer  teknolojisinde  iyi tanımlanmıştır. Advia 120 lazer akış sitometri teknolojisini kullanan ve veteriner paketi olan bir cihazdır. Advia 120’nin veteriner aplikasyonu manuel metotolarla etkileyici bir korelasyonunun olduğu gösterilmiştir. Veterinerlik eğitimi veren  hastanelerde ve referans laboratuarlarında önemsenen çoğunlukla kullanılan bir cihazdır.

İleri hematoloji sitemleri veteriner örneklerin  ilginç yapılarından dolayı kolay etkilenir. Bunlar;

  • Kedigillerde lizise rezistans eritrositler,
  • Kedigillerde dev trombositler ve küme trombositoz,
  • Köpek ve benzeri hayvanlarda  lökosit büyüklüğünün(20-25 %) homojenliği,
  • Olgunlaşmamış/patolojik hücrelerin yanlış sınıflandırılması gibi problemlerdir.

 

Herhangi bir hematoloji sistemi satın almadan önce performansının doğrulanması  bu tür değişiklerin bilinmesi aktif rol oynar. Eğer veteriner kliniğinize bir cihaz almayı düşünüyorsanız bu sistemi değerlendirmek için ;

  • Cihazın çalışmasının kolay olmasına
  • Cihazın sonuç verme hızına
  • Gerekli örnek miktarına,
  • Cihazda mevcut türlere göre,
  • Cihazın bakım gerekliliklerine ve
  • Bilgisayar yönetimi gibi kriterlere bakılması önerilmektedir.

Daha sonra cihazın performansının doğruluğu, kesinliği ve prezisyonu sizin laboratuarınızda kontrol edilir. Sonuçlar referans laboratuar sonuçları ve manuel metolar(periferik yayma) ile karşılaştırılır. Geri elde edilebilirlik için; bir örnek birkaç kez çalıştıralarak kontrol edilir. Bulunan sonuçlar üreticilerle tartışılır. Herhangi bir uyumsuzluk varsa not edilmelidir. Laboratuvarınızda böyle validasyonlar yapmanız birçok kaliteli üreticileri  yüreklendirir vede sıklıkla yaptığınız bütün masraflar ödenir.

 

 

KAN ALMA TEKNİKLERİ

PDFPrintE-mail

Written by selime Saturday, 28 June 2014 18:43

1.1.8. Kan Alma Teknikleri

Kan toplanmak için enjektör veya vakumlu kan tüpleri kullanılır. Enjektörler,plastik ve disposabl kullanımlı, iğnesi güvenli veya kan toplama seti kullanılmalıdır. Genellikle birçok laboratuar yeterli örnek toplamak için 20 ml kapasiteli plastik enjektörleri kullanır.eğer cam enjektör kullanılacaksa, malzemelerinin tam kuru olması gereklidir, çok küçük miktardaki ıslaklık hemolize neden olabilir. Eğer cam enjektörler otklave edilrise kullanmadan önce fırında kurutulmalıdır. Havada kurutma teknikleri önerilmez. 21-23 nolu iğneler  veya 20-23 kelebek setler kan almak için kullanılabilir. Genellikle 21G’den daha küçük iğneler kullanılır. 

Enjektör ile kan alınıktan sonra kan toplama seti emniyetli bir şekilde çıkarılır, enjektörden iğne transfer edilir. Tube standlarındaki tüplere konulur. İğne hemen itilir vakum bitene kadar kan tüplere doldurulur. Altenatif olarak transfer cihazlarına enjektörden kan aktarılır. Enjektörün psitonuyla kanı hızlıca aktarılması hemolize ve antikoagülanın örneğe oranı bozulmuş olabilir.

            Ven kanı alma tekniği çocuklarda ve yetişkinlerde aynıdır. Fakat çocuklar sürekli hareket ettiğinden çocuğun tutulması lazımdır. Bu arzu edilmeyen bir durumdur.

1.1.8.1.Enjektör ile Kan Alınması

Vakumlu kan tüpleri enjektörlerden daha ucuz ve daha uygundur. Fakat enjektör ile kan alma venleri kolay bulunmayan hastalarda yaygın bir şekilde uygulanır. Enjektör kullanıldığında iğne enjektörün ucuna dikkatle yerleştirilir ve iğnenin kılıfı çıkarılır. Enjektörün ekzantrik (dış merkezli) ucu varsa iğnenin ağzıyla aşağı doğru aranje edilir. Enjektör iğne takılır ve vene değdirilir. İğne vene 15 derecelik (deriyle olan açısı) açıyla sokulur(Şekil 1/A). Damarı deldiğimizde ven duvarının direnci galip gelir. Bu basınç enjektörün ileri doğru hareketini kolaylaştırır ve kan enjektörün gerisine doğru akmaya başlar. Enjektörün büyüklüğü alınacak miktara göre seçilmelidir. Nadiren ikinci bir enjektöre gerek duyulur. İkinci bir enjektör gerektiği zaman qauze pad iğnenin ucundan akanı absorblaması için konulur.

Kan alma bittikten sonra enjektörden iğne çıkarılır ve kan uygun tüplere aktarılır.

Kan alma sırasında enjektör hızla geri çekilirse ve başka bir yere transfer edilirken yavaşça yapılmalıdır hızlı yapılırsa kanın hemoliz olmasına  neden olur. Küçük delikli iğne ile kan alınırsa hemoliz daha azdır. Çünkü kanın turbulansı (çalkantısı)büyük çaplı iğne kullanıldığındakinden daha azdır. EDTA’lı tüpden önce biyokimya testleri için SST veya heparinli tüplere kan alındığında yanlış biyokimya sonuçlarını etkileyebilir. Enjektör ile kan alımı sırasında mor tüpden –biyokimya tüpüne geçişde iğne ile kontaminasyon olacağından potasyum sonuçları hatalı yüksek çıkabilir.

1.18.2. Vakumlu Yöntemle Kan Alınması

            Klinik laboratuar testleri için ven kan örneklerinin toplanması test sonuçlarının doğruluğunun saptanması için çok önemlidir. Labortuvar metotları için kan örnek toplama prosedürü aşağıda özetlenmiştir.

Prosedür

1.  Kan örneklerini alacak kişi kendini hastaya tanıtır(Şekil 13/A).

2. Hastanın kimlik bilgilerinin kontrolu hasta tanımlama prosedürüne  göre en az 2 kritere göre yapılır ve hastaya işlemin nasıl yapılacağı anlatılır(Şekil 13/B). Hasta rahatlaması için konforlu bir pozisyonda oturtulur veya yatırılır.

2. Kan almada kullanılaçak malzemeler hazırlanır(Şekil 13/C).Laboratuar istekleri için tüpler seçilir ve tam ve doğru barkodlama yapılır.

3..Kan alınacak ven seçilir.Genellikle antekübital bölgedeki venler seçilir.

4. Eller yıkanır ve eldivenler giyilir

5.  Kan alınacak yer dairesel hareketle temizlenir(Şekil 13/E).

6. Turnike Uygulanır(Şekil 13/D).

7.Kan alma işlemine geçilir. Vakumlu kan alma sisteminde; iğne toplama tüpünün olduğu kısma vidalandığı için ve tüp bu kısmın içine yerleştirilirilir. Kullanmadan önce tüpün tıpası herhangi bir ilave için hafifçe vurularak çıkartılır. Bu işlem vene girmeden önce yapılır. Bu hastanın venine katılanların aspirasyonunu önler(Şekil 13/F-G).

7.1.Holder’ı sağ elinizin baş ve işaret parmakları arasında sıkıca tutarak 15° açıyla damara girilir.

7.2.Sol elinizle destek yaparken sağ elinizin baş parmağıyla tüpü yerleştirlir.

7.3.Kan vakumlu tüpe dolarken sağ elinizle turnikeyi çıkartılır.

7.4. Turnikeyi 1 dakikadan uzun süre tutulmamlıdır.

7.5.Sağ elinizle tüpü çıkartırken sol elinizle de iğneyi sabitlenir.

7.6.Damardan çıkmamaya dikkat edilir.

7.7.Tüp yavaşça 2-3 kez çevirerek kanın tüpün içindeki kimyasal maddeyle homojen şekilde karışması sağlanır.

7.8.Başka bir tüpe daha kan alınacaksa 2.basamaktan itibaren aynı işlemler tekrarlanır.

8. Tüpler dolduktan sonra diğer tüpler doldurulur.

9. Kan alma işlemi bittikten sonra turnike çözülür ve kan alınan yere gazlı bezle basınç uygulanır.Basınç uygulanırken iğne çıkarılır(Şekil 13/H).

10. Kanamanın tamamıyle durduğu kontrol edilir ve kan alınan yere yara bandı veya gazlı bezden yapılmış bandaj konulur ve hastaya bandajın 15 dakika tutulacağı söylenir(Şekil 13/J).

11. Kan almada kullanılan  malzemeler çöpe atılır(Şekil 13/K).

12. Hastanın olduğu yerde heen tüp etiketleri, hastanın adı soyadı, ID numarası, toplama tarihi ve zamanı kontrol edilir(Şekil 13/L).

13. Kan örnekleri saklanır veya örnekler transfer çantalarına veya arabasına konulur ve laboratuara transfer edilir                                           

           
   
 
 
   
 
 
 
 

1.1.8.3. Mikro Kan Toplayıcı Sistemle Kan Alınması(Acil Örnekler)

 Kapiller tpler plazma, serum ve tam kan elde etmek için kapiller yöntemle kan toplamak için kullanılır. Kan dolaşımı yavaş olan kişilerde kapiller kan örnekleri almak uygun değildir. Hipotansiyon veya vasokonstriksiyonda kalp atım hacmi(cardiak out put),  azaldığından böyle hastalarda bundan sakınılmalıdır. Kapiller kan örneği toplamak çok kolay, az teknik gerektirir ve  bu tüplerde antikoagülasyon hızlıdır. Heparinleşmiş kapiller tüplerin içine küçük metal demir konur. Tüpler hemen kapatılır,mıknatıs kullanarak içindeki metal demir parçası hareket ettirilerek iyice karıştırılır.

Yetişkinlerde ve büyük çocuklarda parmak ucunun ortası yaklaşık yarısı bu tip uygulamalar için tercih edilir(şekil). Parmağın en uç kısmı seçilmemelidir. Bu tür uygulamalarda uygun doku kalınlığı ve yer seçmek önemlidir. Bir yaşın altındaki bebeklerde büyük ayak parmağının palntar yüzeyinden veya topuğun orta plantar yüzeyinden veya lateral yüzeyinden deri delinerek kan alınır. Bebekleri bu işlem için incitmekten kaçınılmalıdır. Osteomyelit riski ve kemiğin içine girmekten kaçınmak için yeni doğanlarda deri derinliği 2.4 mmyi geçmemek zorunluluktur(NCCLS). Yeni doğanlarda büyük kan damarlarının bulunduğu alanda delme derinliği 0.35-1.6 mm arasında olmalıdır.

Kapiller kan elde etmek için önce deri dolaşımı hızlandırmak için sıcak nemli bezle ılıklaştırılır. Kan akışı serbest olacağı için istenildiği kadar kan rahatca toplanır. Bu  işlemle toplanacak kan miktarı 0.5 mldır. Isıtma işlemi 3 dakikayı geçmemeli ve sıcaklık derecesi 42 dereceyi geçmemelidir. Sıcak kompres veya sıcak suyla bu işlem yapılabilir.

Kan alınacak yer alkollu padle veya %75’lik isopropanol solusyonuyla temizlenir. Temizleme işleminden sonra yerin kuruması için üzerine steril gazlı bez koyulur. Alkol kalıntılarının hemolize neden olduğu bilinmelidir. Bu kısmı betadinle silinmemelidir. Çünkü potasyum, posfor ve ürik asit testlerinin yüksek çıkmasına neden olur.

Deriyi delmek için tiçari lansetler kullanılır. Bu lansetler otomatik veya manuel olabilir ve aynı derinliği sağlayan değişik çeşitleri vardır.

Kan akmaya başladıktan sonra ilk damla silinir. Delme açısı kanın akışını kolaylaştırır. Eğer kan akmıyorsa gerekirse basınç uygulanabilir.

İlk damla kan atıldıktan sonra kapiller tüplere kan aspire edilir. Tüpü yatay bir şekilde eğilirek veya hafifce kaldırılırak kapiller tüpü tamamiyle doldurulur(şekil).

Sonra kan toplanan tüp dikey pozisyona çevrilir. Kan bu pozisyonda mikrotübün içine doğru akar. Mikrotup içine son damlayı konulmamalıdır. Laboratuvar kağıt mendiliyle kapillerin tüpün ucu silinir. Kapiller tübün üstüne pipet taşıyıcısı takılır. Son damlayı çıkarmak için kapiller tübün içindeki hava çıkarılarak kapiller tüpün içindeki son damla kan çıkartılır. Pipet taşıyıcısını saklanmalıdır.

Kapiller tüp çıkarılır. Antikoagülanla kanın karışmasını sağlamak için nazıkçe karıştırılır. Eğer serum elde edilecekese bu tüpler 30 dakika bekletilmelidir. Bu tüpler için düşük hızlı santrifüjler kullanıldığında 1500 rcf’de 20 dakika santrifüj edilerek serum elde edilir. Yüksek hızlı santrifüj kullanılacaksa  2 dakika santrifüj edilir.

 Bu tüplerle toplanan kanın biyokimyasalyapısı venden toplanankinden farklı olabilir.Deriden kan alınırken sıvıyla karışması halinde kan hemoliz olabilir. Hemoliz birçok deneyleri etkiler. Ayrıca kapiller tüplerle heparinli ve EDA’lı tüplere kan alınarak plazma elde edilebilir. Ançak bu bazı testler için  yeteri kadar kalite sağlamayabilir.

 

Prosedür

1.     Çok az kan gerektiren testler için venden kan almaya gerek yoktur. Bunun yerine deri delinerek belirli yerlerden kan alınır. Fakat bunun fazla infeksiyon riski vardır. Çünkü parmak ucunun sterilize etmek antikubital fossadan daha zordur. Yetişkinlerde veya gelişen çocuklarda kulak memesinden veya ayak topuğunda veya parmak ucundan kan alınabilir(Şekil 14/A).

2.     Kan alan kişi sol elin üçüncü veya dördüncü parmağın uç yan kısmının merkezindeki deriyi doymuş %70’lik isopropanollü pamukla temizlenmelidir. Hemoliz olmaması için alkolin kuruması beklenilmelidir.

3.     Kuruduktan sonra keskin ve steril lanset hızlıca bastırılır(Şekil 14/B).Yarılan yerin derinliği kemikle temas etmeyecek şekilde 2.0 mm.olmalıdır. infeksiyonu minimuma indirmek için her bir parmak için farklı yer seçmelidir.

4.     Parmak ucunda kanın toplanması için elle çekim uygulanmaz. Kan akışını hızlandırmak için parmağı ovmaktan sakınmalıdır,çünkü bu doku sıvısının ve artıklarının doku dışına akışına neden olur. Bundan dolayı alınan örnek plazmayla aynı değildir. Kan dolaşımı hızlandırmak için parmağı delmeden 3 dakika önce ılık nemli bir bezle ılıdılır.

5.     Kanın ilk damlası dışarı akıtılır, sonraki damlalar uygun tüplere aktarılır. Doldurma işlemi pıhtılaşmayı önlemek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Hava kabarcığından kaçınılmalıdır(Şekil 14/C-D).

6.     Kan kapiller çekimle kapiller tüplere alınabilir. Bu tüpler daha çok serum ve plazma elde etmek için kullanılır. Toplama tüpleri piyasada mevcuttur. (Şekil 14/E-G).   Notelson tüpleri (280ml kapasiteli,1.5-1.6mm ID ), caraway tüpleri(350ml 2.5-2.7 mm ID) geniş olarak kullanılır. Bazıları Na ve amonyum heparin ve EDTA gibi değişik antikoagülantlar içerebilir. Bilirubin gibi ışığa hassas analitler için kahverengi camdan yapılmış tüpler vardır. Küçük plastik ve cam tüplerde vardır. Bunların hemoliz gibi bazı dezavantajları vardır. Ayrıca  damla damla kan toplamak hemoliz riskini artırır.

 

A. Kan alınacak yerin  belirlenmesi ve temizlenmesi         B. Lanset Uygulanması

 

 

C. Kanın akışı sağlanır                                             D. İlk damla kanın silinmesi

 

 

E. Değişik tüplere kan örneklerinin alınışı                         F. Tüplerin doldurulması

 

G. Piyasada buluan değişik tüplere mikrokapiller yöntemle kan örneklerinin alınması

 

Şekil 14. Mikrokapiller kan alma prosedürü.

1.1.8.4. Arterden Kan Alma

Arterden kan almak oldukça zordur ve hemşireler veya eğitilmiş teknisyenler veya doktorlar tarafından yapılması gerekir. Bilekteki radyal arterden, dirsekteki brakial arterden ve kasıktaki femoral arterden kan alınabilir. Femoral arterden kan almak zordur. Bunun için yetişkinlerde koldaki arterler seçilir.

Kan alınacak arter nabız atışıyla ve kalın duvarlı oluşuyla ayırt edilir. Kan alınacak yerin etrafı ven de olduğu gibi temizlenmelidir. Turnike gerektirmez. Büyük arterlerde 18-20 lik iğneler kullanılmalıdır. Fakat küçük iğneler 25-30  (0.0-0.64mm to 0.51mm) küçük arterlerden kan almak için kullanılmalıdır. İğne ve enjektör heparin solüsyonuyla doldurulur. İğnedeki ve iğnenin deliğindeki hava boşluğu elimine edilir. Plastik enjektörden kaçınılmalı çünkü enjektörün pompası arter kan basıncı sebebiyle yukarı çıkmaz bazı plastikler gazlarada geçişkendirler. Vakumlu kan tüplerine arter kanı alınmaz çünkü içinde residual hava vardır buda kan gaz değerlerinde değişmeye neden olur. Arterden kan alma zamanı kanamayı minimuma indirmek için 5 dakikadan fazla olmamalıdır.

 

1.1.85. İntravenöz Hat (Katater) İhtiva Eden Koldan Kan Alınması

Central venöz kataterden kanın alınması işlemi için hastaya infüze edilen sıvıyla etkileşmeyen örnek olmalıdır. Sıvıyı kataterde bulunan vanayı kullanarak kesmeli ve 10ml kan vana yoluyla aspire edilir ve dışarı atılır. Central venöz kataterden toplanan kan aynı zamanda alınan perifer ven kanıyla karşılaştırıldığında kompozisyonunda önemli farklılıklar vardır. Kateterin aşağısındaki kolun veninden kan alınabilir. Bu infüze edilen sıvıyla karışmaz, çünkü venlerde geriye doğru kan akışı olmaz. Sıvı örnek yerine ulaşmadan ilk önce kalbe dolaşım için gider sonra dokulara döner.

1.1.8.6. Çocuklardan Kan Alınması

Çocuk hastalardan kan alınması spesifik olarak tasarlanan teknikle eğitimli kan alma ekibi tarafından yapılmalıdır. Çocuk hastalardan kan örneklerinin başarılı bir şekilde alınması için uzmanlık isteyen kan alma tekniği gerektirir. Çocuklardan kan enjektör veya vakumlu sistmele kan alınması yetişkinlerle ayınıdır. Ançak çocukların fizyolojik gelişimlerinin anlamak ve çocuklarla iyi ilşkiler kurmak başarılı sonuç elde etmek için önemlidir. Küçüçük bebeklerden kan almak zordur. Bunların venleri  narin veya ince ve kolayca kollaps olduğu için vakumlu tup methodu kullanılır. Bu çocuklardan enjektör veya kelebek setiyle kan alınır. Daha büyük çocuklarda ve gençlerde en iyi kan alınacak yer kulak memesidir. Küçük çocuklarda ve yeni doğanda örnek daha çok topuktan alınır. Çocuktan kan alınırken dikkat edilecek noktalar;

·       Hastaya rahat, kendinden emin ve prosyonel bir tarzda yaklaşılmalıdır. Hastayı ikna ederek kan alma işleminin biraz acı vereceğini ve sağlık probleminin tedavisi ve tanısı için gerekli olduğunu söylerek işlemi kısa sürede bitirmelidir. Daha büyük çocuklarda kan alan kişi testleri niçin yaptığını açıklamalıdır. Test bilgileri verilirken çok dikkatli olunmalıdır. Kesinlikle çocukların ebeveynlerine spesifik kan testlerinin durumunu ve çocuğun hastalığını söylememelidir. Testin amaçlarıyla ilgili soruları cevaplamalı, açıklamalı cevaplar için hastanın doktoru ile konuşmasını önermelidir. Hasta tanımlanması yetişkinlerle aynı işlemlere göre yapılır. Fazla kan toplamaktan kaçınmak için yapılacak gerekli testlere yetecek kadar alınacak kan miktarı hesaplanmalıdır. Yeni doğanlarda hematokrit artışı nedenyile plazma veya serum çökmesi beklenenden az olacağı unutulmamalıdır.

·       Eğer kan alan kişi hastanın venini bulamıyorsa hastanın hemşiresine kan alacak yeri bulamadığını uygun bir şekilde bildirmelidir. Hemşireden doktoruna kan alma ekibinin kanı alamadığını not etmesini rica etmelidir. Doktor alternatif olarak kapiller toplama yöntemiyle kan alınmasını isteyebilir. Eğer doktor arter veya ven kanı seçerse sorumluluk doktora ait olacaktır. Eğer kan örneğini doktor alırsa uygun bir yorumla bunu hastanın etiketine ilave etmelidir.

1.1.7.8.1. Çocuklardan Kelebek Setiyle Kan Örneklerinin Alınışı

 Kelebek setitle kan alınırken dikkat edileçek noktalar aşağıda anlatılmışyır

1.     Kelebek setinden(kanatlı infüzyon seti)adaptor çıkarılır. Enjektörün pistonu geri çekilerek hava serbest bırakılır. Bu işlem iki kez yapılır.  Uygun adaptörle kelebek setine enjektör takılır. İstenilen testler için mikrotüpler seçilir.

2.     Çocukların hareketliliğin azaltmak için çocuklar kontrol altına alınmalıdır. Bunun için profesyonel kan alıcılar birçok durumlarda çok yumuşak olmalıdırlar ve çocuğun gelişimi ve yaşına göre davaranmalıdır. Çocuğa güven aşılayarak kan almanın gerekliliğini anlatmalı, işini kısaca sinirlenmeden yapmalıdır. Çocuklar genelde kan alan kişileri  yanıdan uzaklaşsın diye hareket ederler. Kan alma işlemini başarmak için çocuğu hafifce dizginlemek için çocuğun yardımı sağlanmalıdır.  Doktormuş gibi numara yaparak kan alma işlemine yardımcı olması sağlanmalıdır. Eğer gerekliyse çocuğun ebeveynine diğer kolunu engelleyerek kan alınacak venden uzaklaştırılması sağlanmalıdır. Korkmuş çoculardan kan almak normal çocuklara göre oldukça zordur. Böyle çocuklardan kan alınırken ebeveynlerden yardım istemek önerilmemektedir. Genellikle bu ebeveynler çocuklarını yeteri kadar dizginleyemezler. Eğer ebeveyn ve diğer kişiler çocuğu dizginleyemzse kan alma işlemi güvenli ve etkin olmayacağına izin vermeyeceği için kan alma ekibi şefine haber verilerek  işlem tamamlanmalıdır. Çocuğun kahramanlığını överek ödül verilmelidir.

3.     Yeni doğan veya küçük bebeklerin kolları için turnike gibi kısa kan alma önerilmektedir. Ven elle yeteri kadar palpe edilerek turnike sıkıca bağlanmalıdır.

4.     Kan alınacak ven alkolle merkezden perifere doğru dairesel hareketle silinmelidir. Alkolun havada kuruması beklenmelidir. Hızlı kuruması için üflenmemelidir.

5.     Kan alma işleminin çocuğa ve ailesine nasıl olacağı anlatılmalı, çok az acı vereceği ve uzun sürmeyeceği söylenmelidir. Çocuğa acı vereceği asla söylenmemelidir.

6.     Güven veren vene iğne yumuşakça eğitilerek sokulur. Kelebek iğnesi uygun ven seçilmezse kapanma eğilimi olabilir. İğne kaldırılarak dikkatlice çevirerek sağlamlaştırılır. Kan alan kişiler her hasta için iki başarısız kan alma işlemi yapmalıdır. Eğer üçüncü gerekirse  bu işlem içi kan alma şefine haber vermelidir. Her bir kan alma işlemi için mutlak ayrı steril iğne kullanılmalıdır. Aynı iğne asla hastaya tekrar  kullanılmamalıdır.

7.     Enjektörle yeteri kadar kan toplamak için pistonu hafifce geri çekilerek enjektöre kanın gelmesi sağlanır. Enjektör hacmine göre kan çekilir.

8.     Turnike sebest bırakılır. Transfer tüplerine örnek transfer edilir.

9.     Enjektör kelebek setinden çıkarılır.  Birçok mikrotüpe örnek toplanacağı zaman enjektörün bağlandığı yerdeki kelebek tubingi gevşetilerek enjektör çıkarılır ve tüpler doldurulur. Son tüp dolmadan önce venden iğne geri çekilmeldiir. Venden iğnenin geri çekilmesinden sonra kelebek setindeki tubinglerindeki kanın uzaklaştırılması pistonun geri çekilmesiyle yapılır.

10.  Transfer tüpleri EDTA, serum ayırıcı(SST) ve hiçbirşey içermeyen tüplere sırasıyla boşaltılır. Herbir tüp 5-10 kez alt üst edilerek antikoagulanın kanın karışması sağlanır. Şiddetli karıştırmaktan kaçınılır.

11.  İğne çıkarıldıktan sonra kan alınan  yere basınç uygulanır. Çocukların kan alınan yere elle değmesine müsaade edilmemelidir. Kanama bitene kadar çocuğun yanından ayrılmamalıdır. Küçük çocuklar ve yeni doğanlarda venlerin büyüklüğü küçük olacağından dolayı venöz basınç artışı fazladır. Bu basınç artışı kan alındıktan sonra serbestce akan kanama yetişkin hastalarda görülenden  daha çoktur. Kan alma işlemi bittikten sonra kan alınan yere basınç uygulandığından emin olunmalıdır.

12.  İğneyi containere dikkatlice atılır.

13.  Kanamanın olup olmadığını ve tamamıyle bitip bitmediğini kontrol edilir.

14.  Gazlıbez uygulanır. Medikal amaçlar için kullanılan yarabandı yapıştırılır. Kağıt olanlar tercih edilmelidir.

15.  Atıkları ve diğer malzemeler temizlenmelidir.

16.  Tüpler örnek etiketlenmesi kurallarına göre etiketlenir.

17.  Doktor örneklerin alındığından haberdar olmalıdır. Kan analizlerinin sonuçları yorumlanacağı zaman kan alma tekniği göz önünde tutulmalıdır. Deriden kan alınarak elde edilen serum veya plazma örneklerini oluşturan kimyasalların konsatrasyonları venöz yoldan elde edile sonuçlarla karşılaştırıldığında önemlidir. Glukoz, potasyum,total protein ve kalsiyum konsntrasyonlarındaki farklılıklar not edilmelidir. Karışıklıktan sakınmak için etiket üzerinde bu durum not edilmelidir.

1.1.9.Farklı Yerlerden Alınan Kanın Bileşimi

Değişik yerlerden elde edilen kanın kompozisyonu farklıdır. Deri delinerek alınan kan ven kanından ziyade arteriyel kana daha çok benzer. Kulak memesinden veya ılıklaştırılmayan deriden elde edilen kan örneği staza bağlı olarak değişiklik gösterir. Ançak bunun istatiksel önemi yoktur. Dolaşımı hızlandırmak için derinin ısıtılması stazisin sebep olduğu farklılıktan daha azdır. Deri delinerek elde edilen kan intrasellular sıvılarla oldukça fazla kontamine olur.

Kısaca kan alma işlemlerini özetlersek;

  • Mümkünse kan sabah 07 - 09 saatlerinde alınmalı
  • Kan, en az 12 saatlik açlık sonrası alınmalı
  • Kan, tanı konmadan ve tedavi başlamadan önce alınmalı
  • İlaç monitorizasyonu esnasında, ilaç alımından sonraki pik ve steady-state fazı düşünülmeli.
  • İstek formunun üzerine kan alma zamanı mutlaka yazılmalı
  • Yanlış zamanda alınan kan, kan almamaktan daha kötüdür
  • Laboratuvar sonuçlarının geç ulaşması kan örneğinin israfı demektir. Boşuna kan alınmış olunur.

1.1.10.CSF ve Vücüt Sıvılarında Toplamak İçin İzlenecek Yollar

Bütün vucüt sıvıları özellikle beyin omurilik sıvısı(CSF) alındıktan bir saat sonra hücre lizisi başlayacağı için  hemen laboratuara gönderilmeldir veya laboratuvar personeline direkt verlir. Bu tür örneklerde hücre sayımı kan sayım cihazlarına verilmemelidir. Laboratuar bütün CSF örneklerini hematoloji laboratuvarına götürmelidir.

Seröz(plevral, peritoneal ve perikardiyal) sıvılar örnekler toplandıktan sonra  hematoloji örnekleri hemen EDTA içine konulmalıdır. CSF örnekleri için standart steril toplama tüplerine alınmalıdır. Sıvılar için toplanması gereken optimum hacimler ve özellikleri aşağıda belirtilmiştir.

  1. CSF örneklerinde hücre sayımı  ve lökosit alt tip sayımı için örnekler 1 mL’lik             steril tüplere veya 5 ml’lik hiçbir antikoagülan madde içermeyen düz tüplere(kırmızı kapaklı)  alınır.
  2. Plevral, peritoneal, perikardiyal ve sinoviyal sıvılarda hücre sayımı  ve lökosit alt tip sayımı için örnekler EDTA’lı tüplere veya koyu yeşil heparin içen tüplere alınır. Örnekler alındıktan  sonra hemen bu tüplere konulmalıdır ve iyice karıştırılmalıdır. Peritoneal ve perikardiyal sıvılarda hemoglobin ve hematokrit sayımı için 3 ml’lik EDTA’lı tüplere örnekler alınmalıdır.
  3. Dializ sıvılarında hücre sayımı için örnekler 3-5 ml’lik EDTA’lı tüplere alınır. Bundan fazla örnek gönderilmemlidir. Örneklerin pıhtılı olmamasına dikkat edilmelidir.

            Örnekler enjektör/iğne takılı veya takısız şekilde laboratuvara gönderilmemelidir. Hematolojik çalışmalarda kullanılacak örnekler şişe veya transfüzyon torbalarıyla gönderilmemelidir. Sıvılar için fazla hacim gönderilmemelidir ve uygun tüplere konularak gönderilmelidir. Buzdolabına konulan örnekler buzdolabına konulmamalıdır. Örneklerde pıhtı oluşması işlemin travmatik olduğunu gösterir. Laboratuara  sıvı gönderilirken örneğin kaynağı mutlaka belirtilmelidir ve etiketlenmelidir.

 

 

KAN SAYIM PARAMETRELERİ-6

PDFPrintE-mail

Written by selime Friday, 27 June 2014 22:36

3.4. Çekirdekli Kırmızı  Hücre (nRBC) Sayım

Olgun eritrositler periferik kanda çekirdeksiz hücre şeklinde dolaşır. Ancak bazı  patolojik durumlarda kemik iliği, eritrositleri tam olgunluğa erişmeden çekirdeği  bozulmamış halde kana gönderir. Bu hücrelere çekirdekli kırmızı kan hücreleri (nRBC’ler) adı verilir. nRBC’ler kanda çekirdeksiz olgun eritrositlerin prekürsörleridir(öncüllerdir). İnsanda nRBC’ler (normoblast) sadece kemik iliğinde bulunur(41).

Laboratuarda manuel nRBC sayımında klasik yöntem morfolojik göz sayımıdır. Bu işlem zaman alır ve yüksek düzeyde eğitimli gözlemci gerektirir. Eğitimli gözlemci olduğunda bile, periferik kanda nRBC varlığının %15 oranında atlanabildiği gösterilmiştir. Bundan dolayı nRBC’nin tarama yöntemi olarak kullanılması uygun olmadığı düşünülürse de hala manuel nRBC sayımı  NCCLS’ye göre referans yöntemdir. Sayılan hücre sayısının azlığı nedeniyle manuel NRBC sayım kesinliği son derece düşüktür. CV’si %30-110 arasında değişir.

        Otomatik cihazlarda nRBC sayımının bu kadar geç bulunmasının nedeni nRBC’den kaynaklanmaktadır. Kan sayım cihaz teknolojisini kullanılarak nRBC popülasyonunun başka maddelerden ayrılmasının güç olduğundan dolayı yakın zamana kadar, kan sayım cihazı üreten firmalardan hiçbiri nRBC sayımı konusuna girmeyi göze almamıştır. Bügünkü cihaz teknolojisi ile nRBC popülasyonunun lenfosit populasyonundan ayrılmasının tüm kan sayım cihazı üreticileri için büyük bir problemdir. nRBC’nin çekirdeği çeşitli büyüklüklerde bulunabilir. En büyük ve olgun olmayan nRBC’ler lenfosit çekirdeğine çok benzeyen büyük çekirdeğe sahiptir. En küçük ve olgun nRBCler eritrosit olgunlaşmasından önce çok küçük bir çekirdeğe sahiptir. Bu çok küçük  hücreler trombosit kümeleri veya dev trombositler gibi hücrelerin özelliklerini kolayca taklit edebilir. Yapılan araştırmalarda sadece nRBC’lere özgü birkaç özelliğin olduğu anlaşılmıştır. Dolayısıyla, nRBC sayımı ya yeni bir teknoloji ile ya da nRBC’leri diğer çekirdekli hücreler ve başka maddelerden ayırmak için mevcut teknolojileri birlikte kullanılarak yapılmaktadır(211)

Otomatik hematoloji cihazları lökosit sayım işleminden eritrositleri  uzaklaştırmak için bir lizis (parçalayıcı)  reaktifi kullanır. Lizisten geriye kalanlar –çekirdekli hücreler- sayılır ve lökosit olarak bildirilir. nRBC’ler mevcut olduğunda bunlar cihazın sayımına dahil edilebilir ve sonuçta cihaz hatalı yüksek lökosit  sayısı ölçer. Bu nedenle düzeltilmiş lökosit sayısının hesaplanması gerekmektedir. Otomatik olarak nRBC ölçmeyen cihazlarda düzeltilmiş lökosit sayısının hesaplanması gerekmektedir. Bunun için nRBC sayısı belirlendikten sonra  düzeltilmiş lökosit sayısı hesaplanır. Düzeltilmiş lökosit sayısını bulmak için

 Düzeltilmiş Lökosit Sayısı=(WBC)x100 / (nRBC+100)

formülüyle cihazın ölçtüğü lökosit sayısı düzeltilebilir(211).

Modern hematoloji cihazlarının birçoğunda örnekte nRBC bulunması durumunda nRBC’ler  flag(uyarı) şeklinde verilmektedir. Cihaz nRBC’ler için WBC histogramını ve/veya lokosit formülü paternlerini esas alarak uyarı verir. nRBC flag uyarıları çoğu zaman kabul edilebilir oldukları kanıtlanmıştır ancak tek başına NRBC uyarı işaretinin duyarlılığı ve spesifikliği düşük olabilir. Bu tür cihazlarda nRBC sayısında herhangibir kuşku duyulduğunda referans metod manuel yöntemle kontrol edilmelidir(212).

3.4.1. Referans nRBC Tayin Yöntemi        

Referans yöntemle hazırlanan periferik yaymalarda nRBC’ler referans yönteme göre sayılır(213). Bunun için; bir damla kan örneği ince bir tabaka halinde yayılır. Romanowsky veya Parlak Krezil Mavisi  boyasıyla boyanır. Periferik yayma örnekleri mikroskop altında incelenir. 100 lökosit başına gözlenen nRBC sayısı bulunur nRBC’lerin WBC’ye yüzdesi şeklinde ifade edilir.

Çekirdekli kırmızı kan hücreleri sayılırken bazen kullanılan büyütme ile lökositlerden ayırt edilemez. Böyle yaymalarda nRBC sayısı yüksek çıkarsa, aşağıdaki formüle göre düzeltme yapılmalıdır:

Gerçek Lökosit Sayısı =  Toplam sayı x 100               

                                           100 + NRBC sayısı

Burada nRBC sayısı ayırıcı sayımda 100 lökositin sayılması sırasında sayılan çekirdekli kırmızı hücre sayısıdır.

3.4.2. nRBC Sayım Sistemleri

3.4.2.1. Akış Sitometrisi ile nRBC Sayımı

Bu metodlar zaman alıcı, pahalı ve flow sitometri uzmanlığı gerektirir.Ayrıca ölçülen skalaların klinik yoruma da  fazla bir katkısı yoktur. Bu teknoloji rutin otomatik kan sayım cihazlarından elde edilen nRBC sonuçlarının doğrulanmasında referans metod olarak kullanılabilir. Monoklonal antikor kullanarak ölçüm yapan  flow sitometrik metotların CV’leri %20’den düşüktür(41).

3.4.2.2. Kan Sayım Sistemleri ile nRBC Sayımı

3.4.2.2.1. Coulter LH 750

Coulter LH 750 sistemlerinde nRBC sayımı laboratuarın etkinliği ve maliyetler açısından ve ayrıca rekabette yer almak için bir gereklilik haline gelmiştir(214). Coulter-LH 750  cihazında  nRBC sayımı lökosit alt tip sayımının integral bir parcasıdır ve herhangi ilave bir reatif gerektirmez. Cihazda mevcut  tüm teknolojileri CBC empedans ve VCS teknolojisini kullanır. VCS teknolojisi volum ayrımı için(V) ve yüksek frekanslı iletkenlik© ve laser ışık saçınımı gibi lökosit sayımı için uygulanan gelişmiş algoritmaları kullanır. Sayım, büyüklük tayini ve işaretleme için kullanılan algoritmalar  çercevesinde yapılır. Cihaz analizöründen iş istasyonuna transfer  değişikliği ile ileri işletim gücünün en dinamik şekilde kullanımı ile sürekli iyileşme imkanı vermektedir. Algoritma uygulamaları ile sinyal/gürültü oranını azaltmak için solid state elektronik donanım kullanılarak nRBC “özgün pozisyonunun” hem diferansiyel veri grafiğinden hem de WBC histogramından belirlenebilir. LH 750 cihazında NRBC sayımı için kullanılan teknoloji AccuCount ve AccuGate teknolojisinin kombinasyonudur. AccuCount teknoloji Coulter prensibine dayanır ve WBC histogramını kullanır. AccuGate analizi ise 3D veri analizini kullanır. Bunlar  iletkenlik(Z ekseni), hücre volumu(Y ekseni) ve laser saçınım ışık okumalarından(X ekseni) oluşmaktadır. Algoritmalar kullanılarak yükseklik çizgisi ayarları ile hücre popülasyonları ayrıştırılır. Bu özgün pozisyonlar nRBC’lerin etkin biçimde sayılması için bilgi vermektedir(215). Düşük level nRBC sayısı(her lökosit sayısı için 0-15 nrbc sayısı)hesaplanır(212).

3.4.2.2.2. Sysmex XE-2100

Sysmex XE-2100 cihazındaNRBC sayımı için eritrositler özel bir reaktif ile lizise uğratılır, NRBC varlığında çekirdekli eritrositlerin çekirdekleri aynı anda ayrılır, büzülür ve açık tonda boyanır(211). Bu lizis reaktifi lökositlerin şekillerini korurken; intrasitoplazmik organel ve çekirdekleri yoğun olarak boyar. Lökosit ve çekirdekli eritrositler arasındaki farklı boyama yoğunlukları ve  hacim farklılıkları ayırt edilerek floresans yoğunluğu ve ileri ışık saçınım ile iki hücre populasyonunun tam ayrımı yarı iletken laser ile yapılır. İki hücre populasyonun  belirgin şekilde ayrıştırlır.XE-2100 cihazında nRBC kanalının flow sitometri scattergramında y-axisinde ileri saçınım ışık şiddeti, x-axisinde ise floresans şiddeti bulunur. NRBC leylak rengi lökosit ise soluk mavi demet şeklinde bulunur. Koyu mavi demet ise RBC hayaletlerini  oluşturur. Küçük lenfositlerden ortokromatik nRBC’lerin açık ayrımı da not edilir. XE-2100 cihazının software’inde yer alan “nRBC# Doğrulama Algoritması” işletilerek nRBC’yi,  lökosit ve alt tip sayımlarından çıkartarak WBC & DIFF değerlerini doğruladıktan sonra, kesin sonuç olarak verir(216).

3.4.2.2. 3. Cell-Dyn 400

Cell-Dyn 4000 cihazı eritrosit sitoplazma membranını parçalayan ve hem çıplak nRBC çekirdeklerini hem de canlı kalmamış (permeabl) lökositleri boyayan yeni bir lökosit reaktifine(propidyum iyodür)sahiptir(217-218). Bu boya lökositlerde minimum değişiklik yapar. Sağlam lökositler boya almadan kalır ve nRBC’lerden ayrılır. Cell-Dyn 4000 nRBC’leri lökositlerden doğru bir şekilde ayırmak ve tayin etmek için argon-iyon lazer ve akış sitometri analizini kullanır. Sıfır derecede aksiyel ışık kaybının 3 boyutlu uzamada üçlü eşik tetikleme devresi, 7 derecede ara açılı saçınım ve kırmızı floresan kullanılır. Diğer lökositler(non-viable) ise cihazın software’nde yer alan algoritma ile hücre büyüklük ve boyanma karakterlerine göre nRBC’lerden  ayırt edilir. Floresan DNA ölçümünden sonra nRBC’ler tanımlanarak kesinlikle patoloji tayin edilir. Bu özelliği sayesinde nRBC bulunan örneklerde lökosit sayısını düzelterek kesin sonuçlar verir. Bu, diğer faktörler ile enterferans olmadan mutlak nRBC sayısını ve nRBC/100 WBC oranını verir.

3.4.2.2.4. Abx Pentra DX 120

ABX Pentra DX 120 cihazı otomatik olarak  tiazol oranj boyasını kullanarak direkt nRBC sayımı yapmaktadır. nRBC sayımında cihazda bulunan mevcut teknolojileri kullanır. İmpedans, flourometrik, sitokimyasal, absorbans ve flow sitometrik(DHSS) yöntemleriyle nRBC’ler sayılır ve lökosit sayısı otomatik olarak  düzeltilir.(219).

3.4.3. nRBC Sayımının Anlamı

nRBC’ler normalde sadece fetus ve çok küçük bebeklerin kanında bulunur. Sağlıklı erişkinde kemik iliğiyle sınırlıdır ve sadece hastalıkta dolaşım kanında bulunur; varlıkları genellikle ilik üzerindeki aşırı baskıyı, ekstramedüler hematopoezi veya ilik replasmanını gösterir. Dolaşımda çok sayıda çekirdekli kırmızı hücre özellikle yenidoğan hemolitik hastalığında (eritroblastosis fetalis) ve talasemi majörde bulunur(41,212).

nRBC’ler normal erişkin insanların periferik kanında görülmez. Fetal ve neonatal dönemde NRBC’ler periferik kanda bulunur ve genellikle doğumdan sonraki bir hafta içerisinde kaybolurlar. nRBC’ler hamile kadınların periferik kanında nadir olarak  bulunur ve çoğu zaman fetal kanın transplansental hemorajisiyle ortaya çıksalar da, anne kaynaklı da olabilirler. nRBC’nin memelilerde kemik iliğinden periferik kana geçmesini önleyen mekanizma kesin olarak açıklığa kavuşturulamamıştır. Çekirdeğin hücrelerin kemik iliğinden salınmasında önemli bir engel olması ihtimali yoktur çünkü çekirdekli granülositler ve lenfositler rutin olarak ilikten salınırlar. Retikülositlerin ilik stromasından periferik kana geçişindeki azalma ve gelişmiş hücre iskeletiyle ilşkili olabilir. Hücrelerin kemik iliği kompartmanından periferik kana doğru gerçek hareketi iki kompartman arasındaki basınç gradyanına bağlı olabilir(220). Bazı hastalık durumlarıyla ilişkili olarak periferik kanda nRBC’lerin bulunduğu uzun zamandır bilinmektedir. Birçok çalışmalarda hem hematolojik hem de hematolojik olmayan hastalıklarda nRBC’nin varlığı bildirmiş ve periferik kanda nRBC varlığının kötü prognoz ile ilişkili olduğu vurgulanmıştır(220). Bu hastalıklar aşağıda belirtilmiştir. Perinatal dönemde periferik kanda nRBC’nin artışı kronik hipoksi ve çeşitli nedenlere bağlı anemi, viral enfeksiyonlar, konjenital kalp hastalığı, akciğer yetmezliği ve diğer birçok durum ile ilişkilidir. Çocuklarda periferik kanda nRBC’nin varlığı neoplastik ve neoplastik durumları içeren  hastalık durumları ile ilişkili olabilir(Tablo 22).

Tablo 22. nRBC Artışıyla İlşkili Durumlar

 

Kemiğe Metastaz Yapan veya Yapmayan Solid Tümörler,

Hem Akut Hem de Kronik Hematolojik Maliniteler,

Hemoliz,

Nütrisyonel Anemi,

Hemoraji,

Enfeksiyöz Mononükleozis,

Miyelodisplazi Gibi İyi Huylu Hematolojik Durumlar; Septisemi,

İnflamatuar Barsak Hastalığı,

Kronik Akciğer Hastalığı,

Kırıklar,

Miyokard Enfarktüsü,

Karaciğer Hastalığı ve birçok başka hastalığı içerir

Benin hematolojik durumlar

Bu veriler Tsuji T, Sakata T, Hamaguchi Y, Wang Fu-Sheng. New Rapid Flow Cytometric Method for the  Enumeration of Nucleated Red Blood Cells: Cytometry 1999; 37: 291-301.

 

 

   

KAN SAYIM PARAMETRELERİ-5

PDFPrintE-mail

Written by selime Friday, 27 June 2014 22:30

3.3. Retikülosit Sayımı

 

Retikülosit olgunlaşmamış eritrositlerin en son safhasıdır. Olgun eritrosit haline gelmeden önce bir retikülosit iki gününü kemik iliğinde bir gününü de periferik kanda geçirir. Retikülosit veya olgunlaşmamış RNA içeren çekirdeksiz eritrosit sayımı, kemik iliğinin anemi gibi bir fizyolojik duruma yanıt olarak,  eritrosit sentezleme ve dolaşıma verme kapasitesi hakkında yararlı bilgiler vermektedir. Retikülositler ilikten kana geçtikten bir gün sonra RNA’larını kaybeden olgunlaşmamış eritrositler olduğundan, retikülosit sayısı eritrosit üretim hızının bir göstergesidir(41, 63).Eskiden manuel yöntemle supravital boyalarla boyanmış örnekler kullanılarak retikülosit olgunluğunun tayini  yavaş ve subjektif bir yöntemdi, teknik değişkenliklere açıktı ve doğruluğu düşüktü(164). Daha sonraları akış sitometri yöntemleri retikülosit alt popülasyonlarının sınıflanmasında kullanıldı(165-166) Olgunlaşmamış retikülositler  fazla miktarda RNA içerirdiğinden parlak floresan ve yüksek ışık saçınım özellikleri gösterirler. Akış sitometri yöntemleri kesinliği arttırdı ancak cihaz teknolojileri, boyama ve veri analizi yazılımındaki farklar varlığını korudu. Spesifik retikülosit analizörleri analiz yazılımı aracılığıyla operatör müdahalesini ortadan kaldırarak daha fazla standardizasyon sağladı(167-168). Bugün ise retikülosit sayımı otomatik kan sayım sistemlerinin rutin parametreleri arasına girmiştir.

Retikülosit sitoplazmasında RNA kalıntıları bulunduğundan RNA krezil mavisi gibi vital boyalarla yayma yapılarak mikroskopta manuel olarak sayılabilmektedir. Kan yeni metilen mavisi veya parlak krezil mavisi boyasıyla kısa süre inkübe edildiğinde, RNA boya-ribonükleoprotein kompleksi şeklinde çökelir. Manuel sayımlarda çökelmiş RNA boyanır ve  retikülositler koyu mavi ağ veya granüller (hücre başına en az iki) şeklinde görülür. Retikülosit sayımı için önerilen ve retikülosit/eritrosit oranını esas alan referans yöntem yayınlanmıştır(164); bu yöntem 1994 yılında yayınlanan ICSH eritrosit sayım referans yönteminin genişletilmiş halidir(119). Mikroskopta dikkatli sayılan retikülosit sonuçları tatminkar olabilir. Manuel yöntemde CV’nin %25 ile >%50 arasında değiştiği bildirilmiştir. Bunun nedeni  yaymadaki değişkenlikler, boyamadaki farklılıklar, incelenen hücrelerin sınırlı sayısı ve teknisyenler arası farklardır.

Manuel retikülosit sayımları, miyelotoksik veya hematinik tedavi alan hastaların seri değerlendirilmelerinde ve düşük veya normal değerlerde sınırlı değer taşıyabilir. Manuel retikülosit sayan merkezlerde, hematokritleri düşük olan hastalarda retikülositlerin kemik iliğindeki yapımı hakkında doğru fikir verebilmeleri için düzeltilmiş retikülosit sayısının hesaplanması gerekmektedir. Düzeltilmiş retikülosit sayısı aşağıdaki formülden faydalanılarak hesaplanmaktadır.

Düzeltilmiş Retikülosit Sayısı(%)=Retikülosit(%) x Hct/45

Mutlak retikülosit sayısı bir µl kandaki retikülosit sayısını göstermektedir Mutlak retikülosit sayısının (% Retikülosit x RBC) eldesi düzeltilmiş retikülosit yüzdesi kavramı gereksinimini ortadan kaldırmaktadır(41).

Otomatik kan sayım cihazlarında metilen mavisi veya floresan RNA bağlayıcı boyalarla retikülosit sayısının mutlak değeri saptanabilmekte ve özellikle manuel yöntemin yetersiz kaldığı düşük-normal değerlerde retikülosit değerleri belirlenebilmektedir. Mikroskopta bin eritrosit sayılarak retikülosit yüzdesi bulunurken, otomatik kan sayım cihazlarında optik scatter yöntemiyle enaz 30 bin hücre sayılmaktadır. Sysmex R-2000, Sysmex XE-2100, ABX PENTRA 120 Retic, Coulter STKS, Coulter GenS, Coulter LH 750 ve Cell-Dyn 4000 ve bunların üst modelleri otomatik retikülosit sayımı yapmaktadır(169). Böylece retikülosit sayımları rutin tam kan sayımı parametreleri arasına eklenmiş oldu. Otomatik kan sayım cihazlarında mutlak retikülosit ölçüldüğünden  düzeltilmiş retikülosit sayısı kavramı ortadan kalkmaktadır.

3.3.1. Referans Retikülosit Sayım Yöntemi

NCCLS H-44-A2 ikinci baskısında belirtilen referans metod aşağıda özetlenmiştir(170).

NCCLS retikülosit metod karşılaştırmaları için yenimetilen mavisi(NMB) boyama metodunu önermektedir. Fakat, manuel ve subjektif bir yontem olduğu için, NMB metodunun sensitivitesi, tekrarlanabilirliği, tutarsızlığından ve metodun özelliğinden dolayı  kısıtlamaları vardır. Retikülosit akış sitometrelerinin  ilk kalibarasyonları ve/veya retikülosit sayımlarını doğrulama; hasta örneklerinin NMB metodu ile sayılmasıyla veya daha önceden ayarlanmış retikülosit sayım cihazıyla ayarlanmalıdır. NMB prosedürleri en az 2000 hücre kullanılarak deneyimli kişiler  tarafından yapılmalıdır.

3.3.1.1. Referans Boya

            NCCLS retikülositlerin boyanması için yeni metilen mavisi boyasını önermektedir. Bu boya  yaklaşık %90 oranında boya maddesi içermektedir. Polikrom metilen mavi boyasının saflaştırılmış maddesi olan Azure B, manuel retikülosit boyamaları için uygundur. Bu boya saf olduğu için kan tablalarına çökmez. Bu boyayı hazırlamak için 100mL iso-ozmotik  olan fosfat tamponunun içine 0.1 gram NMB eklenir;  pH 7.4’e ayarlandıktan sonra çozelti 24 saat bekletilir ve aralıklarla çalkalanır. Kahverengi bir cam şişede 2 ila 6º C arasında depolanır. Bu sıcaklıkta bu çözeltinin ömrü 1 aydır. Kullanmadan önce belli bir hacimdeki miktarı süzülerek boya çökeltilerinden arındırılır. Değişik alternatif  boya solüsyonları manuel retikülosit sayımında  kullanılabilir.

NOT:Alternanif boya solüsyonları;Modifiye metilen mavisi solüsyonu: 0.5 gram NMB, 1.4 gram Potasyum Oxalat ve 8 g Sodyum Klor  distilesuyla 100 ml’ye tamamlanır. 2. Parlak krezil mavisi  SOlusyonu : 1.0 gram Brillant Crecil Blue boyası 99 ml %85 lik NaCl’e tamamlanarak süzülerek kullanılır).

1.3.1.2.  Prosedür(Referans Metot)

1. Lamların Hazırlanması : Kan örnekleri EDTA antikoagülanı içine alınır. Eşit hacimdeki NMB boyası ve kan;  cam ve ya da plastik test tüpü içinde 10 kez yavaşça çevrilerek veya aplikatörle iyice karıştırılır. Anemik ya da polisitemik durumlarda, boya maddesinin kana oranı bu duruma göre ayarlanır. Ortam sıcaklığında 3 ila 10 dakika bekletilir. Kan ve boya karışımını cam lam üzerine koymadan önce iyice karıştırılmalıdır(Şekil 31/A-B).

A. Bir damla kan örneği üzerine bir damla boyanın konulması             

 B. Aplikatörle kanın iyice karıştırlması

C. Bir damla kanın alınması                                                     

D. İyice karıştırılmış karışımın lama konulması     

E. Yaymanın yapılması

Şekil 31. Manuel retikülosit sayım prosedürü (referans metot)

1.     Yaymalar iki cam lam yöntemiyle hazırlanır ve ortam havasında kurumaya bırakılır(Şekil 32 C-E).  Yağ immersiyonlu objektifde mikroskop ile bakıldığında retikülositler açık mavi ve koyu mavi retiküler veya granüler materyal içerirler.  Eritositler ise açık mavi veya mavi-yeşil boyanırlar(Şekil 32/A).

S
 
 

SAyma Prosedürü: Kan yaymaları eritrositlerin düzenli yayılmasını görebilmek için küçük büyütme ile (100x büyütme) incelenmelidir. Eritrositler birbirlerine yakın  ancak ne rulo formunda nede  birbirlerine değmelidirler. Sayılan eritrositlerin sayısı retikülosit oranına göre değişir. Tam doğruluğun elde edilmesi için sayılması gereken  eritrositlerin sayısı Tablo 19’da gorülmektedir.

         Tablo 19. Retikülosit Prezisyonu için Sayılması Gereken Eritrosit Sayısı

 

Retikülosit(%)

                         Varyasyon Katsayısı

       %2                           %5                                  %10

0.01

247.500

39.600

9.900

0.02

122.500

19.600

4.900

0.05

47.500

7.600

1.900

0.10

22.500

3.600

900

0.20

10.000

1.600

400

0.50

2.500

400

100

Miller Disk ile sayım yapılmadığında sayılan toplam eritrositlerdeki nRBC sayısı. Miller disk kullanıldığında Tablo’daki eritrosit sayılarının 1/9’ i alınır.

a.      Merceğe takılan Miller diski görüş sahasının üzerine iki kare (bir kare diğerinin alanının dokuz katıdır) yerleştirerek çok sayıda eritrositin hızla sayılmasını sağlar (Şekil 17/A)(171). En az 300 hücre sayılıncaya kadar büyük karede retikülositler ve küçük karede eritrosit ardışık mikroskopik sahalarda sayılır. Bu, en az 2700 eritrositteki retikülosit sayısını verir.

Eğer miller diski kullanılıyorsa, yüksek sayıdaki retikülositlerde küçük miller diski içinde eritrositleri sayarken köşe kuralı uygulanmalıdır. Küçük kare büyük karenin ortasında ya da köşesinde olabilir(Şekil 33/B-C). Köşe kuralına göre büyük karenin sağ tarafina ya da alt tarafina değen eritrositler sayılmamalıdır. Eğer köşe kuralı uygulanmazsa, miller disk kullanılarak yapılan sayım ve kullanılmadan yapılan sayım arasında belirgin bir fark olacaktır. Miller disk kullanılmadığı zaman sayım %30 daha fazla çıkar.

Örnekteki doğru retikülosit sayısını(%1.2) bulmak için şekil 33/C’deki sayımlar için aşağıdaki förmül kullanılır.

 

 Retikülositler (yüzde) =    Büyük karelerdeki retikülosit sayısı            x 100

      Küçük karelerdeki eritrosit sayısı x9

     

9

 

Hsaplamalar : Eğer miller diski kullanılmamışsa, retikülosit sayısı ve eritrosit sayısı ayrı ayrı işaretlenmiştir. Retikülositlerin yüzdesi aşağıdaki gibi hesaplanır:

Retikülosit(%) =    Retikülositlerin toplam sayısı____________ x 100

                                              Eritrositler ve Retikülositlerin toplam sayısı

Eğer miller diski kullanılmışsa, küçük karenin alanı büyük karenin alanının 1/9’una eşit olacağından retikülosit yüzdesi şöyle hesaplanır:

Retikülosit(%) = 20 büyük karedeki retikülosit toplam sayısı_____  x 100

                              20 büyük karedeki eritrositlerin toplam sayısı x 9

Retikülositlerin mutlak sayısını öğrenmek için retikülositlerin oranı aynı kan örneğinde bulunan eritrosit sayısı ile çarpılarak bulunur veya retikülosit analiz ölçüm cihazı  veya kontrolü iyi yapılmış kan sayım cihazı kullanılarak yapılır. Mutlak retikülosit sayısı aşağıdaki formülden hesaplanır.

Mutlak Retikülosit Sayısı (x109/L) = RBC(x1012/L) x retikülosit (%) x 10-2

Manuel saymalarda minimum 1.000 hücre sayıldığı için sayım hataları miller disk kullanılarak azaltılırsa da ve miller disk kullanılarak da yapılan sayma hatalarından dolayı bu sayma metodları otomatik retikülosit sayma metodlarının doğrulanmasında veya kalibrasyonunda kullanılmamalıdır.

3.     Varyasyon Kaynakları: Gerçek retikülositlerin çok küçük bir sayısı belirlendiğinden, retikülosit sayımındaki örnekleme hatası oldukça yüksektir. %95 güven limitleri şöyle ifade edilebilir:

R ± 2                             

Burada R yüzde cinsinden retikülosit sayısı ve N incelenen eritrosit sayısıdır. Bu, sadece 100 eritrosit incelendiğinde, %1 sayım için %95 güven limitlerinin %0.4-%1.6; %5 sayım için %3.6-%6.4 ve %10 sayım için %8.1-%11.9 olduğu anlamına gelir. Herhangi bir eritrosit iki veya daha fazla mavi boyanmış patikül içeriyorsa retikülosit olarak sayılmalıdır.

Anemiden dolayı düşük hematokritli hastalarda, kanda eritrosit sayısı düşük olacağından yüzde retikülosit sayısı  hatalı  yüksek olabilir. Bundan dolayı düzeltme faktörü kullanılmalıdır. Düzeltme normal hematokrit %45’göre yapılır. Düzeltme yapmak için aşağıdaki formül kullanılır.

 

Düzeltilmiş retikülosit sayısı(%)= Gözlenen retikülosit sayısı(%) x  Hct(%)  

                                                                                                                   %45                   Bütün vücut sıvılarında , kan kemik iliği veya diğer aspiratlarda amniyotik sıvısında,  kord aspirasyonlarında retikülositler bu metotla sayılır.  Görünür hemolizli, pıhtılı, uzun süre beklemiş(6 saatten fazla) ve aşırı ısıya bırakılmış veya dondurulmuş örneklerde retikülosit sayımı yapmak doğru değildir.

                                                                                             

3.3.2. Retikulosit Sayımında Kullanılan Otomatik Kan Sayım Cihazları ve Akış Sitometri Cihazlarının Özellikleri

Akış sitometri kurallarına veya statik sitometri metotlarına göre, retikülosit sayımında kullanılacak olan otomatik retikülosit ölçüm sistemleri belli bir hücresel özelliği ölçmelidir. Bunun için retikülositlerin olgun eritrositlerden ayrılması sağlanmalıdır. Periferik kanda bulunan lökosit, eritroblast ve plateletler gibi diğer kan hücrelerinden de ayırmak  gereklidir. Şimdilerde, ayırma işlemi için RNA’nin florokrom veya supravital boyalarla boyanması ile yapılmaktadır. Florokromların RNA’ya bağlanmasıyla retikülositler floresan özellik kazanır.Yaşlı hücreler hemoglobinlerindeki porfirin halkasından dolayı daha düşük seviyede otofloresansa sahiptir. Boyanmış retikülositlerin floresan özelliği bu hücreleri otofloresan özelliği olan hücrelerden ayırabilmek için yeteri kadar yüksek olmalıdır. Yeni metilen mavisi veya oxanize 750 gibi supravital boyaların birleştirilmesiyle boyanmış retikülositlerin diğer retikülositlerden daha fazla ışık emmesine olanak sağlar. Aynı ölçümler, ortalama miktardan RNA içeren olgun retikülositlerin içinde daha fazla RNA içeren genç hücrelerden ayrılmasında kullanılır(örneğin olgunlaşmamış retikülosit oranı, IRF). Bütün boya maddeleri, sinyalleri giderici sürekli kullanılan ilaçlar(orn: anthrasiklinler) veya patolojik koşullar(örn: sıtma, infeksiyon, Heinz cisimcikleri, or howell-jolly cisimcikleri) gibi interfere edici durumlarda çalışılarak  zararlı durumlar belirlenerek incelenmelidir.

3.3.2.1. Ölçüm aralığı: Retikülosit ölçüm sayıcıları; öçülebilir kesitte tam ve doğru retikülosit ölçümleri vermelidirler. Sıfıra yakın sayıda retikülosit örneklerini (örneğin myeloablatif kemoterapiden sonra) ve yüksek sayıda retikülosit örneklerini de (hemolitik anemi de veya megaloblastik anemi da B12 vitamin tedavisinde) içermelidir. Aynı şekilde, olgunlaşmamış retikülosit oranları da aynı kesit içinde tam olarak ölçülmelidir. Özellikle en düşük retikülosit sayılarında, çünkü bunlar klinik yararlarının en fazla olduğu örneklerdir, ve bu parametreler normal veya anormal eritropoetik rejenerasonun erken belirtileridir.

3.3.2.2. Akış Sitometri için Örnek Hazırlama : Önekler cihaz üreticisi tarafindan belirlenen metotlara göre hazırlanır. Kabul edilebilir sayıdaki retikülositler için böyle sert önlemlerin alınması zorunludur.

İşlemler:Kullanım talimatları, tam otomatik kullanım koşulları olsa bile, kullanım kılavuzunda açıkca belirtilmelidir. Aşağıdaki konular detaylı açıklama isteyen konulardır.

  • İlgili hücre topluluklarını ( eritrositler + retikülositler) ilgisizlerden ayırmak için kullanılacak sistem, örneğin; lökositler, eritroblastlar ve plateletler,
  • Boyanmamış eritrositleri boyanmış retikülositlerden ayırmak için kullanılacak sistem,
  • Genç retikülositlerin ölçülmesinde kullanılacak sistem,
  • Belirlenebilir bütün retikülosit parametrelerinin kalibrasyonu ve kalite kontrolünde kullanılması gereken yöntemler
  • Zararlı maddelerin veya hücresel elemanların belirlenmesinde kullanılmış olan metodların ve işaretlerin gösterilmesidir.

3.3.2.3. Cihaz Ayarları ve Kalibrasyonu : Cihazin optik ve elektronik kısımları üretici talimatlarına göre ayarlanmalıdır. Cihaz ayarları en düşük değerde değişken saçınım, florasan ve emme sinyalleri ile en yüksek değerde yoğunluk sağlamalıdır. Optik ayarlama ve sinyal genişletmesi ayarları, floresan mikrobeadlerini olduğu gibi standartlaştırılmış boylardaki ve yoğunluklardaki yapay parçaları gerektirebilir.

Fotomultiplier voltajının ayarlanması, laser çıkışı, elektronik kazançlar ve sinyalden sesin ayrılması gibi teknik olaylar doğru olarak ayarlanmalı ve üretici talimatnamesine gore kişisel kalite kontrolunun bir parçası olarak periyodik olarak test edilmelidir. Retikülosit sayım yöntemlerinin doğrusallığının düzenli olarak değerlendirilmesi ve (örneğin yarım senelik veya öncül cihaz servisiyle) ölçüm aralığının doğruluğu yapılmalıdır..

Cihaz kalibrasyonu, doğru ölçüm sonuçlarını elde etmek için spesifik koşullar altında yapılan analitik proseslerin ayarlanmasıdır. Kalibrasyon cihazın üreticisi tarafindan belirlenen metotla yapılmalıdır. Eğer cihazın bulundugu yerde kalibrasyon yapmak gerekirse, kalibrasyon için cihazın retikülosit sayılarının ölçüm aralığını kapsayan en az 3 adet taze kan örneği kullanılmalıdır. Birincil kalibrasyon için, doğru ve kesin retikülosit sayısı gerekir (CV~%2); rutin kalite kontrolleri için daha düşük bir  kesinlik (CV~%5) yeterlidir.

Değişik retikülosit oranlarında 2,5 ve %10’luk seviyelerde gerekli olan yaklaşık eritrosit sayısı Tablo 18 de belirtilmistir. Referans metodu(referans ölçüm prosedürü) olsa bile kabul edilebilir oran 1% ve 2% arasında bile  tamamen elde edilemez.

Bunun için NMB-boyasıyla boyanmış 3 adet periferik yayma hazırlanır. İkisi daha önceden belirlenmiş gözlemciler tarafindan sayılır, üçüncüsü ise gerekirse hakem tarafından sayılır. Bu yaymalar önceden belirlenmiş koordinator tarafindan basit kör kod kuralına  göre boyanır. Her referans analiz için en az 2000 hücre ya da Tablo’18 de belirtilen miktarda hücre sayılmalıdır. Kod numarasına göre tanımlanan sonuçlar değerlendirme için kordinatore teslim edilmelidir.

Kordinator, en az iki gozlemci tarafindan ölçülmüş olan aynı retikülosit sayılarının matematiksel ortalamasını hesaplamalıdır. İki gözlemcinin hesapları arasında uyumsuzluk meydana geliyorsa bunlar 1 adet daha gözlem yapmalıdırlar. Eğer bu sayım az onceki iki ölçümün arasına düşüyorsa bu alınmalıdır diğer türlü en yakın iki sayımın ortalaması alınmalıdır. Retikülosit yüzde değerleri iyi kalibre ve kontrol edilmiş bir hücre sayıcısıyla sayılan eritrosit  sayısı kullanılarak retikülosit sayım miktarına çevrilmelidir.

3.3.3. Retikülosit Sayımı için Kullanılacak Akış Sitometreleri ve Otomatik Kan Sayım Cihazlarının Performans Testleri

Retikülosit sayımı için kullanılan otomatik cihazların performans testleri; doğruluğun, carry-overin, karşılaştırabilirliğin, doğrusallığın, gerçekliğin, örneklerin bekleme süresinin ve interferans kaynaklarının belirlenmesini içermelidir. Bu belirleme; genelde boyanmış hücrelerin tüm eritrositlere oranı olan direkt akış sitometrik ölçümü de içermelidir. Bütün analitik görünüşlerde kan hücre analizlerinin değerlendirilmesi için ICSH kılavuzları kullanılabilir. Bunun için pratik klinikte oluşabilen retikülosit sayısının bütün seviyelerindeki örnekler kullanılabilir. Anormal hücreli örnekler veya yüksek oranda Hovell-Jolly cisimleri, Sıtma veya Diğer hücre içi parazitleri, Lenfositoz, Trombositoz veya Eritroblastozisgibi retikülosit sayımını interfere eden diğer kan bileşenleri de  bu değerlendirme için incelenmelidir.

3.3.3.1. Karşılastırma(Korelasyon) metotları : Doğruluk, daha önce kalibre edilmiş metodun kabul edilmiş değerleriyle ve test cihazının bu “referans” değerleriyle karşılaştırılmasıyla sağlanır. Doğruluk için daha oy birliği sağlanamadığından dolayı buna karşılaştırma, korelasyonveya anlaşma metodu olarak bakılabilir. Karşılaştırılabilirlik, rutin prosedürlerle elde edilen değerlerin cihazdan daha önce elde edilen değerlere uyum sağlayan sonuçlar üretmesine denir. Retikülosit sayımı için;  cihaz metodu ile yapılan çift analizlerin ortalama değerlerinin, karşılaştırılacak metodun çift analizlerinin ortalamalarının karşılaştırılmasıyla yapılır.

Cihaz kalibrasyonu ilk kurulurken üreticilerin talimatnamesine gore yapılmalıdır. Tekrar yapılan kalibrasyon ya da doğruluğun ve doğrusallığın doğrulanması cihaz ureticisi tarafından veya labarotuvar tarafindan her zaman  periyodik olarak gerçekleştirilmelidir. Cihaz performansını gösteren kalite kontrol çalışmaları ve yeterlilik testleri veya test performansını etkileyen kritik parça değişimleri veya önemli koruyucu bakımlar yapıldığında bu çalışmalar yapılmalıdır.

Olgunlaşmamış retikülosit oranı gibi retikülosit ile ilgili parametrelerin kalibrasyonu ticari kalibrator ve standartların olmayışı nedeniyle daha problemlidir. Değişik retikülosit boyama metodlarında, IRF’deki değişkenlik hem reaktif hem de rutin verilerin analizinden dolayıdır.

3.3.3.2. İşlemler : Cihazın doğrulanmasının kesinlik  prosedurüne başlamadan önce test sonuçlarının kabul edilmesi için prezisyon çalışmalarının tamamlanması gereklidir. Çünkü doğruluk(acuracy) çalısmaları test prosedürlerinin  prezisyonundaki bir hata ile geçerliliğini yitirebilir. Bu prosedür, aynı örneklerin hem karşılaştırma yöntemi ile hemde otomatik metod ile dikkatli incelenmesini gerektirir. IRF ile ilgili çalışmalar, numune toplanmasıdan itibaren 6 saat içinde yapılmalıdır. Özellikle IRF parametrelerinin karşılastırılması sırasında örneklerin analizi için laboratuarların bir şema hazırlamaları önerilir.

Otomatik retikülosit sayım metodu; üreticinin önerdiği analitik prosedürlere gore yapılmalıdır. Her örnek, referans metod karşılaştırmaları için kullanılacak matematiksel ortalamanın hesaplanması için iki kez incelenmelidir. Bu veriler ayrıca sınırlı sayıdaki örneklerin test edilmesi ile cihazın performansının periyodik olarak doğrulanmasında kullanılabilir. Labaratuvar referans metodu kullanılarak cihazın kalibrasyoununun doğrulanmasi için regression  analizi de kullanılabilir.

3.3.3.3. Testin Özgünlüğü : Retikülosit analizinin özgünlüğü DNA ve/veya RNA gibi floresan boyalarla boyanabilen diğer hücre materyalleri ile zayıflatılabilir. Belirli hücresel ve hücre dışı elementler  metodun spesifikliğine ters yönde etkileyebilir(Tablo 20). Bu güçlü interferanslardan en sık rastlanılanları trombosit kümeleri, lökosit fragmanları(bekleyen örnekler ve lösemik örnekler), çekirdekli eritrositler, eritrositlerdeki Howell-Jolly cisimcikleri içermesi ve sıtma gibi intrasellüler parazitlerdir.

Tablo 20. Akış Sitometri Cihazları için Bilinen veya Güçlü İnterferanslar

Hücresel Elementler

Hücresel Cisimcikler

Değişik

 

Trombosit Kümeleşmesi

Howell-Jolly Cisimcikleri

Çeşitli İlaçlar(Antrasiklinler, Florescein) ve Porfiria İle Otofloresans

 

Bazofilik Noktalanma

Heinz Cisimcikleri

Anormal Eritrositler

 

Dev Tombositler

Ppanheimer Cisimcikleri

Paraproteinler

 

Lökosit ve Lökosit Fragmanları

 

Parazitler (Sıtma, Babasia)

Soğuk Aglütininler

Çekirdekli Eritrositler

 

Trombosit/Eritrosit Karmaşıklığı(Coincidience)

 

 

 

Hemoliz

 

Veriler NCCLS Dökümanından Alınmıştır( H44-A2, 2004).

 

        İçlerinde herhangi bir DNA veya RNA elementi içeren hücreler boyalarla/florokromlarla boyanabilir ve böylece  akış sitometrelerinin florasan tayin   metodlari ile retikülosit gibi sayılabilirler.

        Eğer analizör eritrosit sayımı sırasında soğuk aglutininler varsa yanlış düşük retikülosit sayısı görulebilir. Bu teknikte; interferanslar hücre populasyonlarını ayıran gateleri veya ayırıcıları da etkiler. Cihaz üreticileri herhangi bir potansiyel interferansı kendi cihaz destek materyallerinde açıkca belirtmelidirler. Bu cihazlar için analitik prosedürler bu interferanslar ortaya çıktığında kullanıcıyı uyarmalıdırlar ve olduğunda ayarlanan gate ayarlarının bozulmasına yol açan uyarıları vermelidir.

3.3.3.4. Testin Duyarlılığı: Akış sitometrik cihazlar; düşük retikülosit yüzdelerini oldukça güvenilir bir şekilde kantitatif olarak ölçebilir. Bu kesinlik, doğruluk, taşıma(carry over) ve metodun  biasına bağlıdır. Cihazın duyarlılığının tayininden önce bütün bu kriterlerin hepsi test edilmeli ve uygun olarak bulunmalıdır.

Duyarlılık klinik performans gereksinimlerinin limitlerine göre test edilmelidir. Bu karmaşık bir konudur çünkü retikülositin tam tanımı ayarlamanın bir fonksiyonudur, örneğin test sistemi ve referans metodu verileri için regression’un eğimi ve eksen kesim yeri 1 ve 0 olmayabilir. Buna rağmen, belirli sistemdeki sayısal limitlerin değişik yapılması gerekebilir.  Bu değer doğruluk analizinden elde edilmelidir. Örneğin, eğer test sistemi NMB metodu ile doğrusal olarak 0.5 eğim ve 0.1 kesim yeri ile korele ise ve bir önce kurulmuş olan NMB performans limitleri %0.1 ise test sistemi icin limit %0.15 olmalıdır. Otomatik retikülosit sayımının performansı için retikülositler %1.0 ile 0 arasındaki örnekleri içermelidir.    

       Doğruluk analizinden elde edilmiş denklemler %0.1 NMB retikülositine eşit olan ayarlama seviyesinde netliki bulmada kullanılabilir. Klinik performans için tam gerekli limitinin bulunması referans limitlerinin belirlenmesinden ve test sistemi ile geniş deneyimden sonra yapılabilir. Bu ard arda yapılan yaklaşımlardan oluşan bir sistem oluşturur. Örnegin, kemik iligi nakli yapan retikülosit ayarlaması yapan bir laboratuvarda %0.01 ve %0.1 seviyeleri arasında retikulositlerin belirlenmesi gerekir. Bu ancak cihazın bilinen duyarlılığının altında yapılan örneklerin analizinden sonra bilinebilir ve bundan sonra rutin olarak test edilmelidir ve böylece cihaz labaratuvar için gerekli olan limitlerde çalışır.

Doğrusallık skalasında en alt nokta olduğundan dolayı duyarlılık aynı zamanda doğrusallıkla da ilgilidir. Lineerliği test etmek ve duyarlılığı bulmak için, aşağıdaki prosedürler izlenmelidir.

(1)  Normal veya orta derecede yüksek retikülosit sayısı(~150x109/L) içeren bir örnek seçilir ve “örnek H.” olarak adlandırılır. Labaratuvarda ayarlanmış en düşük dereceli(~5x109/L) ikinci bir örnek seçilir ve bunun adını “örnek L.” koyulur. Soğuk agglutininler içeren örnekler kullanılmamalıdır. Düşük retikülosit kanın güzel bir kaynağı kemik iliği transplantı olan hastaların posttransplant kan örneğidir. Tipik olarak kemik iliği aktivitesinin retikülosit sayısı %0.1 veya daha düşüktür.

(2)  İki kan örneği santrifüj edilerek plazma uzaklaştırılır. Fizyolojik tampon tuzu(PBS) veya uygun tuz solusyonları  ile yıkanır(50 ml). Bu basamak değişik hacimlerdeki koyu olmayan sıvıların doğru pipetlenmesi içindir. Gerekiliyse az miktardaki plazmayı uzaklaştırmak gerekir.

(3)  0,10, 25, 50, 75, 90 ve 100 olarak yazılan 7 tüp hazırlanır. Her tübe sırasıyla 0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 0.9 ve 1mL seyreltilmiş örnek H. ekle.; ve sırasıyla 1, 0.9, 0.75, 0.5, 0.25, 0.1 ve 0 mL lik seyretilmiş örnek L eklenir. Her tüp karıştırılır. santrifuj edilir, PBS i uzaklaştırılır, ve her tüpe 0.060mL ABO-uyumlu plazma eklenir. Tekrar karıştırılır ve her tüpten gerekli miktar test etmek için ayrılır.

(4)  Sonuçları elde ettikten sonra aşağıdaki denklemler kullanarak tahmin edilen mutlak retikülosit değerleri ve retikülositlerin yüzde değerleri hesaplanır.

1. Ear = ahr + (1-a)lr

            2. Eat = aht + (1-a)lt

            3. E% r= Ear/Eat x 100

                                                                                                  

Ear =  Beklenen Mutlak Retikülosit Sayısı(x109/L)

a= Tüpdeki kanın yüksek retikülosit fraksiyonu( örneğin, 0,0.1,0.25,1.0 gibi)

hr = Örnek H’daki mutlak retikülosit sayısı

lr= Örnek L’deki mutlak retikülosit sayısı

Eat =  Beklenen mutlak RBC sayısı (x109/L)

hr = Örnek H’daki mutlak eritrosit sayısı

lr= Örnek L’deki mutlak eritrosit sayısı ve

E% r= Retikülosit yüzdesi

          Tahmin edilen mutlak retikülosit sayıları bağımsız değişken olarak kullanılır ve ölçülmüş değerler ise bağımlı değisken olarak kullanılır.Doğrusal  regresyon yapılır. Doğrusallık ve duyarlılık gözlemler, eğim, eksen kesimler ve r2 değerleri incelenerek kontrol edilebilir. r2 > 0.98 koşullarında birey rastgele dağılmış gözlemler düşünülebilir.

3.3.2. Retikülosit İndeksleri

Hücrelerde bulunan RNA miktarına dayanarak retikülosit olgunluk derecesini sınıflamak için yöntemler geliştirilmiştir. Çeşitli cihazlara göre değişik indeksler hesaplanabilmektedir.  Klinik önemi olan indeksler aşağıda belirtilmiştir.

3.3.2.1. Ortalama Sferik Hücre Hacmi(MSCV): Herediter sferositoz tanısında MSCV ve MCV’nin birlikte rutin tarama testi olarak   kulanılabileceği  yönünde birçok çalışma devam etmektedir(173-175).

3.3.2.2. Retikülosit Hemoglobin İçeriği(CHr); Retikülosit hemoglobin miktarı kanda hipokromik retikülositlerin sıklığını belirtmek için kullanılan bir terimdir. Bazı otomatik analizörler retikülositlerin ortalama eritrosit hacmini (MCVr) ölçebilmektedir. Şu anda sadece Advia 120 cihazında CHr ölçümünü yapılmaktadır. Ancak başka bir otomatik retikülosit analiz cihazında ölçülen RBC-Y ve Ret-Y ölçümleri yapılmaktadır. Bu parametrelerin demir eksikliği veya hipokromik eritrositler ile korelasyon gösterdiği bildirilmiştir;  Hipokromik retikülositlerin ölçümü; fonksiyonel demir eksikliği durumlarının belirlenmesinde klinik yararını gösteren son yayınlar; CHr veya Ret-Y’ye eşdeğer retikülosit parametrelerinin otomatik ölçümüyle klinikte kullanımı daha da artacaktır. NCCLS, Ret-Y ve RBC-Y parametrelerini henüz kabul etmiş değildir. CHr nin klinik yararı birçok çalışmalarla doğrulanmıştır. Demir depolarını retikülosit düzeyinde direkt gösteren bir parametredir. Çocuklarda demir eksikliğinin tanısında en güçlü erken tanı prediktörüdür. Hemodiyaliz hastalarında fonksiyonel demir eksikliğinin tayininde doğru ve hızlı yapılan duyarlı bir testtir. Aynı zamanda pediatrik ve erişkin hemodiyaliz hastalarının intravenöz demir tedavilerinin takiplerinde ve rekombinant eritropoetin (rHuEPO) tedavisi sonrası ortaya çıkan fonksiyonel demir eksikliği anemisinin takibinde çok önemli bir parametredir(170).

Bu parametrenin rutin uygulamalar arasına girmesiyle; retikülositlerdeki hemoglobin düzeylerinin ölçümlerinde kalite kontrol ve kalibrasyon yöntemlerine ihtiyaç duyulacaktır.

3.3.2.3. Olgunlaşmamış Retikülosit Fraksiyonu (IRF);IRFterminolojisi konusunda konsensusa Uluslararası Laboratuar Hematoloji Birliği’nin (ISLH) ve NCCLS’nin çabalarıyla ulaşılmıştır. İlk  çalışmalarda keyfi olarak verilen ortalama floresan yoğunluk birimleri ile ifade edilen “retikülosit olgunluk indeksi” terimi kullanılmıştır. Daha sonraları retikülosit olgunlaşmamışlık ölçümlerini tarif etmek için literatürde başka birçok terim kullanılmıştır. Bu terimler “RNA indeksi”, “RNA miktarı”, “yüksek düzeyde floresan retikülositler” ve son olarak “olgunlaşmamış retikülosit fraksiyonu”nu terimlerini  içerir. NCCLS son baskıdan bu yana, hem üreticiler hem de klinisyenler ISLH konsensusu tarafından önerilen: “olgunlaşmamış retikülosit fraksiyonu” (IRF)  terimini kabul ettiler. Ayrıca  A.B.D. Gıda ve İlaç Kurumu (FDA) tanısal amaçlı olarak kullanılmak üzere en az üç üreticinin cihazında kullanılan IRF’yi onayladı ve gittikçe klinik kullanımı arttı. Ancak cihaz ve reaktif performansları ve referans aralıkları farklı olduğundan, her bir laboratuar üreticinin tavsiye ettiği referans aralıklarını kendi performans özelliklerine dayanarak belirlemeli veya doğrulamalıdır. Üreticiler, klinisyenler, laborantlar ve standart belirleyen organizasyonlar arasında işbirliğiyle; IRF klinik uygulamalara daha fazla girmesi gereken yeni bir parametredir.

Retikülosit olgunluk indeksi veya IRF,  eritropoezin bağımsız bir parametresini temsil eden, retikülositlerdeki orantılı RNA ölçümü olarak tarif edilebilir. Retikülosit olgunluk ölçümünü sağlayan bu parametre olgunlaşmamış hücrelerin toplam retikülositlere veya eritrositlere oranı olarak da tanımlanır(170,172).  Olgunlaşmamış retikülositler değişime uğramış veya strese olmuş hücreler olarak adlandırılır. IRF  eritrositlerin sola kaymış hücreleri olarak da adlandırılır.  Bu hücreler  fazla miktarda RNA’ya sahiptir ve nükleazlar RNA’yı üç gün içerisinde degrade ederler. Genç retikülositler yoğun eritropoetik stimülasyon dönemlerinde periferik kan dolaşımına çıkarlar. Olgunlaşmamış retikülositler büyüktür ve ışık saçınım  metoduna göre sınıflandırılırlar. RNA seviyesi yüksek olan örneklerde ışık saçınım özelliği de yüksek olacaktır. Olgunlaşmamış retikülosit sayısı  total retikülosit sayısının % 5’ inden daha azdır. Olgunlaşmamış retikülositler kemik iliği üretimini stimüle eden tanımlanmış tedavilere cevap veya çeşitli anemilerde ve hemoraji gibi eritropoetik stimülasyonu şiddetle arttıran periyodlar sırasında periferik kana salınırlar(176). Otomatik retikülosit sayımı laboratuarlarda retikülosit sayımının kesinliğini arttırmıştır. Ayrıca bir retikülosit popülasyonunun olgunlaşmamışlık düzeyini gösteren ek bir retikülosit parametresinin bildirilmesinden sonra bu parametrenin klinik kullanımına yönelik ilgi artırmıştır.

3.3.2.3.1. IRF’nin Klinikte Kullanımı: Son yıllarda teknolojideki son ilerlemeler ile klinisyenlere daha kesin retikülosit sayımları ve önemli değer taşıyabilecek yeni retikülosit parametreleri kullanıma girmiştir. En fazla ümit veren  parametrelerden biri tıbbi uygulamalarda pratik yarar sağlayan olgunlaşmamış retikülosit fraksiyonudur. IRF, plazma transferrin reseptörü veya serum eritropoetin düzeyleri gibi daha karmaşık ve daha pahalı testlere göre daha ekonomik bir alternatif olabilir. Bu  yeni parametre gelecek için büyük bir ümit vermektedir ve klinisyenlere ve araştırmacılara eritropoez dinamikleri hakkında daha fazla bilgi verebilir. IRF tayininin klinikte kullanılabileceği durumlar aşağıda özetlenmiştir(177-183).

  • IRF ve retikülosit sayısının beraber kullanılması durumunda kemik iliği transplantasyonlarından sonra stem cell rejenerasyonunun monitorizasyonunda, molar çok ya
  • Yoğun kemoterapiden sonra kemik iliğinin rejenerasyonunun monitorizasyonunda,
  • Vitamin B12, folat ve demir tedavilerinin monitorizasyonunda, 
  • Kemik iliği üzerinde toksik etkileri olan ilaç etkilerinin monitorizasyonunda,
  • Eritropoetin alan hastaların tedavilerinin monitorizsyonunda,
  • Böbrek transplant hastalarının greft fonksiyonlarının  monitorizasyonuunda,  
  • Anemilerin  sınıflandırılmasında,  tanı ve tedavisinde,
  • Neonatal transfüzyon gerekliliği ve  prognozun değerlendirilmesinde
  • Aplastik krizlerin tayininde kullanılabilir.

Olgunlaşmamış retikülosit fraksiyonu ve mutlak retikülosit  sayısının tanısal değeri Tablo 21’ de gösterilmiştir(184-190)

Tablo 21. Farklı Klinik Durumlarda Mutlak Retikülosit Sayıları İle Olgunlaşmamış Retikülosit Fraksiyon Değerleri Arasındaki Etkileşimler

Olgunluk İndeksi

Retikülosit Sayısı

Klinik Durum

Aneminin Altta Yatan Nedeni

Yüksek

Düşük

Kemik iliği graftı

Kemoterapi veya radyasyondan sonra transplantasyon ve ardından allojenik veya otolog kemik transplantasyonu

Yüksek

Yüksek

Kronik hemoliz

Hemolitik anemi

Yüksek

Normal-düşük

Bozulmuş hemoglobin sentezi

Demir eksikliği

Yüksek

Normal-düşük

Bozulmuş DNA sentezi

B12 vitamini veya folat eksikliğine bağlı megaloblastik anemiler

Yüksek

Normal-yüksek

Yakın tarihli hemoraji

Travma, anevrizma rüptürü, cerrahi

Yüksek -normal

Yüksek -normal

Bozulmuş hemoglobin sentezi

Talasemi

Yüksek -normal

Normal-düşük

Klonal proliferatif bozukluklar

Miyelodisplastik sendromlar

Yüksek -normal

Düşük

Kemik iliği yetmezliği veya hematopoetik hücre kaybı

Hipoplastik anemi

Normal-düşük

Düşük

Kemik iliği yetmezliği veya hematopoetik hücre kaybı

Aplastik kriz

Düşük

Normal

Kemik iliği malinitesi

Miyeloid veya lenfoid maliniteler

Düşük

Düşük

Kemik iliği yetmezliği veya hematopoetik hücre kaybı

Aplastik anemi

Veriler ‘ Koepke at all. Current limitations in reticulocyte counting: implications for clinical laboratories. The Emerging importance of accurate reticulocyte counting. Miles, İnc. Diagnostic Division, Tarrytown, 1993,  18-22. Davis at all. Flow cytometric reticulocyte analysis and maturtiy index. Clinical Flow Cytometry. 1993:677:281-292’den alınmıştır

3.3.4. Retikülosit Sayım Sistemleri

3.3.4.1. Görüntü Analizi İle Retikülosit Sayımı

Görüntü analizi retikülosit yöntemi kesinliği manuel retikülosit sayımı ile akış sitometri yöntemleri arasındadır. Hematrak 590 cihazı (Geometric Data, Wayne, PA) kullanılarak görüntü analizi ile yapılan retikülosit sayımı Hematrak 590’ın üretimine son verildiği için artık kullanılmamaktadır.

Retikülosit sayımı ve antinükleer antikor analizi prosedürleri Mayıs 1996’da Micro21 System (Intelligent Medical Imaging, Inc., Palm Beach Gardens, FL) cihazı için yayınlanmıştır. Micro21 retikülosit sayımlarının tanımlanmasını otomatize eden akıllı bir otomatik mikroskop sistemidir. Retikülosit olgunluk sınıflaması yapmaz(41).

3.3.4.2. Akış Sitometrisi İle Retikülosit Sayımı

Akış sitometrisi  yöntemi retikülosit sayımının kesinliği arttıran ve daha fazla hücrenin analiz edilmesini sağlayan bir yöntemdir(191-192). Bu yöntemle çok sayıdaki hücre yüksek bir tekrarlanabilirlik ve giderek artan bir doğruluk ile sayılabilmektedir. Akış sitometrisi retikülosit prosedürleri için nükleik asitlere bağlanan floresan boyalar kullanır. Propium iyodür, etidyum bromid, pironin Y, akridin oranj, tioflavin T, dimetiloksakarbosiyanin, dietilkinoliltiasiyanin iyodür, tiazol oranj, auramin 0 ve korifosfin-0 gibi çeşitli boyalar kullanılmaktadır. Klinik laboratuar testlerinin çoğunda tiazol oranj ve auramin-O kullanılır. Bu yöntemlerin dezavantajları yüksek maliyet, zaman alan hazırlıklar ve deneyimli veya son derece teknik operatörlere duyulan ihtiyaçtır. Ayrıca bazı boyaların karsinojen olma olasılığı vardır.

Retikülositlerin akış sitometrisi ile sayımı artık pratik bir yöntemdir. Yüksek sayıda hücre sayımı rutin uygulamada hassasiyeti ve doğruluğu  arttırarak retikülosit analizinin yararını ve kullanım alanını arttırır. Bazı prosedürler retikülosit indeksleri hakkında da bilgi verir. Manuel yöntemlerle 1000 hücrenin incelenebilmesine karşılık akış sitometri yöntemlerinde  ortalama 30 000-50 000 hücrenin incelenmesi nedeniyle kesinlik anlamlı olarak artar.

Başlangıçta retikülositlerin akış sitometrik analizi çoklu-fonksiyonlu akış sitometrelerde karmaşık prosedürler ve floresan boyalar kullanılarak yapılmıştır. Daha sonraları bu prosedürler EPICS® XL gibi bazı akış sitometrelerinde MCL System II TM yazılımı ve Retic-STAT TM boyası kullanarak otomatik hale getirilmiştir. Diğer bir sistem tiyazol turuncu floresan boyalar kullanarak ölçüm yapan Becton Dickinson FACscan sitometrisidir. Bu sistemle yapılan sayımların tekrarlanabilirliği çok daha iyidir ve referans aralığı diğer yöntemlere benzer. Ancak bu yöntemde, Howell-Jolly cisimcikleri, çekirdekli eritrositler, oraklaşmış hücreler ve dev trombositlerin olduğu durumlarda yanlış olarak yüksek değerlerin çıkması mümkündür(193).

TOA şirketi hassasiyeti 5-10 kat daha yüksek, tek başına çalışabilen Sysmex R-1000 adlı otomatik bir retikülosit analizörü geliştirmiştir. Sysmex R-1000 auramin-O kullanır ve otomatik aspirasyon, dilüsyon, inkübasyon ve ölçüm yapar. TOA yüksek düzeyde floresan ayırt edici özelliği ile Howell-Jolly cisimcikleri, çekirdekli eritrositler, oraklaşmış hücreler ve dev trombositler ile interferansı ortadan kaldırdığını iddia etmektedir(194). Lazer ışını kullanan cihaz floresan yoğunluğunu  öne saçınım yoğunluğuna göre ölçer ve grafik oluşturur . Retikülositler düşük, orta ve yüksek floresan oranına göre gruplanır (LFR, MFR, HFR). Hassas akış sitometrisi retikülosit fraksiyonları(HFR, MFR) kemik iliği transplantasyonundan sonraki iyileşme veya graftın erken dönemde izlenmesi ve kemoterapinin monitörizasyonunda kullanılır. Sysmex R-3000 otomatik olarak sadece retikülosit sayar. Bu cihazın hızı  saatte 80 testtir(195). Sysmex R-1000/-3000 ve FACScan Retic-Count ile yapılan retikülosit sayımlarında, lökositlerin retikülosit şeklinde sınıflanmasından dolayı spesifikliği düşüktür. Sysmex R-3000’in plasmodium falciparum ile enfekte eritrositleri retikülosit olarak saydığından yanlış yüksek retikülosit sayısı verdiği de bildirilmiştir(196).

3.3.4.3. Kan Sayım Sistemleri ile Retikülosit  Sayımı

Çok yakın bir tarihte, hematoloji analizörlerine retikülosit analizi dahil edilmiştir. Böylece özel veya çoklu-fonksiyonlu akış sitometrisine  gereksinimin ortadan kaldırılarak orta-büyük ölçekte laboratuarlara doğru ve acil retikülosit sayımı  imkanı sağlanmış oldu. COULTER® STKS, MAXM, GenS, LH750 Analizörleri, Abbott CellDyn® 3500 , Bayer H*3TM ve ADVİA 120 cihazları  hem beş tip lökosit formülüyle beraber CBC  hemde çoklu-parametreli retikülosit bilgisi sağlar. Bu cihazlar floresan boyalar yerine yeni metilen mavisi veya oksazin gibi nükleer boyalar kullanır. Retikülosit analizinin hematoloji analizörlerine eklenmesiyle testin maliyeti böylece azaltılmış oldu(41,63,167-169).

3.3.4.3.1. Sysmex Serisi Cihazlar

Sysmex serisi cihazında retikülositler yarı iletken laser ve floresan bir boya kullanılarak flow sitometrik olarak ölçülür(197-198). Boya reaksiyonu Sysmex R retikülosit analizörünün prensibiyle aynıdır. Hem ileri ışık saçınımı  hemde floresan bilgisiyle  retikülositler sayılır ve retikülosit olgunlaşma bilgileri elde edilir. Trombosit  sayımı da bu kanalda yapılır.  Sysmex XE-2100 cihazında  retikülositler polymethine nükleik asit floresan boyası ile çekirdekli eritrositlerdeki RNA’lar boyanır. Her hücre flow cell içindeki yarı iletken diyote laserden tek tek geçerler. Her örnek için yaklaşık 30.00 hücre sayılır. Lökositler ve çekirdekli eritrositler yüksek floresan artışından dolayı retikülosit ve diğer eritrositlerden ayrılır. Bu cihazlarda retikülositler yüzde ve mutlak sayı olarak verilir. Bu analizör hücrenin RNA içeriğine dayanarak retikülosit alt parametrelerini de  verir. Analiz edilen her bir hücrenin ileri ışık saçınımı ve floresansda yoğunlaşma ile RNA içeriği ve hücre büyüklüğü ayrıştırılır ve hangi olgunlaşma safhasında olduğu saptanır. Yüksek  floresans oran (HFR), orta floresans oran (MFR) ve düşük floresans oran (LFR) tayin edilir. Olgunlaşmamış retikülosit fraksiyonu HFR ve MFR işlemiyle elde edilir ve yüzde olarak rapor edilir(197).

3.3.4.3.2. Technicon Serisi Cihazlar

          Technicon H*3  cihazı oksazin 750 boyası ile 15-90 dakika inkübasyondan sonra boyanmış kanları offline olarak analiz eder. Her RBC ve retikülosit için sitometre volüm, hemoglobin miktarı, hemoglobin konsantrasyonu ve düşük açılı saçınım, yüksek açılı saçınım ve abzorpsiyonun eşzamanlı ölçümü ile floresan boyanmayı belirler. Bayer ADVIA 120 en son geliştirilen cihazdır ve otomatik RBC ve lökosit formül sayımına ek olarak Oksazin 750 boyasını kullanarak otomatik retikülosit sayımını içerecek şekilde ayarlanabilir. Bu cihazlarda retikülosit hücresindeki hemoglobin miktarı ölçümünün(CHr) demir eksikliği eritropoezinin ve demir tedavisine yanıtında yararlı erken bir göstergesi olduğu saptanmıştır(199-200).

 3.3.3.4.3. Coulter Serisi Cihazlar

Beckman Coulter cihazları retikülosit sayım prosedüründe; eritrositler içerisindeki rezidüel RNA’yı çöktürmek için yeni metilen mavisi boyasını kullanır(200-202). Kan boya ile karıştırılır ve beş dakika süreyle inkübe edilir. Boyanan örneklerin bir kısmı eritrositteki hemoglobini uzaklaştıran ancak boyanmış RNA’yı hücre içerisinde tutan hipotonik bir solüsyon ile karıştırılır. Daha sonra örnek COULTER MAXM veya COULTER STKS cihazına aspire edilir ve VCS teknolojisi kullanılarak incelenir. Coulter GEN.S programlandığı zaman on-line olarak otomatik tam kan sayımı, lökosit alt tipi ve retikülosit sayımı yapabilir. Coulter LH 750 cihazında retikülositler tam otomatik olarak ölçülmektedir. Beckman Coulter’in retikülosit analiz yönteminde retikülositlerin sayılması ve sınıflanması için hücrenin incelenmesinde özgün bir akış sitometri yöntemi kullanılır. Hücreler Coulter VCS Teknolojisi (Volüm, İletkenlik ve Işık Saçınımı) kullanılarak eş zamanlı üç boyutlu analiz ile tanımlanır. Hücre büyüklüğünün belirlenmesinde doğru akım ölçümleri kullanılır. İletkenlik (radyodalgası sıklığı) hücrenin iç özellikleri hakkında bilgi verir. Hücreler helyum-neon lazer hüzmesinden geçerler ve saçınan ışık yüzey özelliklerini ve hücre granüllerini saptamak için tayin edilir. Coluter LH 750 serisi retikülositleri VCS teknolojisi ve advanced intelikinetik ve accugate teknolojisi ile ölçer(203).

3.3.4.3.4. Cell-Dyn Serisi Cihazlar

Abbott Cell-Dyn 4000 rutin olarak CBC’nin bir parçası olarak tam otomatik random accses retikülosit ölçümleri yapan ilk hematoloji analizörüdür. Cell-Dyn 4000 argon lazer kullanır(203-204). 488 nmde mavi laser ışığı kullanılarak retikülositler otomatik olarak sayılır. Boya olarak da DNA veya RNA’ya bağlanarak 530 nmde floresans veren 488nmde ekscite olan asimetrik cyan boyası kullanılır. Bu boya kinetik işlem ile ölçümü azaltıp hızlı bir boyanma sağlar. Düşük retikülosit konsantrasyonlarında dahi yüksek sensitivite veren güçlü bir floresan boyadır ve WBC ve NRBC ayırımında DNA ve RNA boyamalarında iyi ayırım gösterir(205). Cell-Dyn 4000 lökositlerden, olgun eritrositlerden ve trombositlerden  retikülositleri ayırmak için  optik ışık saçınımı, retikülositleri trombositlerden ayırmak için ve impedans prensiplerini uygular. Ayrıca floresans metot ile olgunlaşmamış retikülosit fraksiyonunu da ölçer. IRF floresans boyanma ile orantılı olarak RNA konsantrasyonunun ölçümüyle saptanır(206).

3.3.4.3.5. ABX Pentra 120

ABX Pentra 120 cihazındanükleik asitlere spesifik floresan bir boya  Thiazol Orange (Becton Dickinson, San Jose, CA)  kullanılarak retikülositler offline olarak ölçülür(197, 207. Tam kan boya ile karıştırılır ve 35 C° de 25 dakika süreyle inkübe edilir. Hücreler  argon iyon lazer kullanılarak flow cell içinde analiz edilir. Böylece ileri ışık saçınımı  ve floresans sinyal  ve  resistivity  yoluyla ölçülen hücrenin büyüklüğü ile ilgili 3 tip bilgi sağlanır. Bu cihazda maksimum 32.000 hücre analiz edilir. Her bir örnek için uygun gate(kapılar) kullanılarak retikülositler trombositlerden, lökositlerden ve olgun eritrositlerden ayrılır. Sonuçlar  RNA içeriği y ekseninde, hücre volümü x eksenine gelecek şekilde retikülosit matriksi gösterilir. Retikülosit olgunlaşması RNA içeriğine göre düşük RNA içeriği (RetL), orta RNA içeriği (Ret M) ve yüksek RNA içeriği (RetH) gibi sınıflandırlır. Ayrıntılı retikülosit içeriği ortalama floresans indeks (MFI) kullanılarak kantite edilir. Buna ilave olarak matriksin olgunlaşmamış alanındaki olgunlaşmamış retikülositler ve çekirdekli RBC’ler gibi  floresans elementler  de böylece kantite edilir. IRF ,

RetH+ RetM+ IMM/ total retikülosit  

işlemiyle hesaplanır ve fraksiyon olarak ifade edilir(aralık 0.0- 1.0. Sysmex cihazlarında  kullanılan yüzde formatı yerine bu cihazlarda kullanılan fraksiyon formatı daha çok tercih edilen formattır(208, ISLH workshop 1997).

ABX sistemlerinin yeni modelleri tam otomatik olarak retikülosit ölçmektedir

3.3.5. Retikülosit Sayımının Anlamı

Retikülosit sayısı kemik iliğinin eritropoetik aktivitesi hakkında fikir verir ve MCV gibi anemilerin sınıflandırılmasında kullanılan kliniğe yardımcı önemli bir parametredir. Rutin retikülosit sayımının önümüzdeki birkaç yıl içinde CBC’nin bir parçası olacağı  düşünülmektedir. Retikülosit tayininin klinikte kullanılabileceği durumlar aşağıda özetlenmiştir(209).

  • Pediyatri kliniğine düşük hemoglobin değeri ile gelen çocuklarda  eritrosit üretiminin normal veya anormal olduğunun bilinmesi tanı açısından önemlidir.
  • Konjenital aplastik anemi ve geçici çocukluk eritroblastopenisi sıfır retikülosit sayısı sık görülür ve tanıda hekimi bir adım ileri götürür.
  • Pediyatride görülen başka bir hastalık hemolitik üremik sendromdur. Hemolitik üremik sendrom, trombotik trombositopenik purpura ile çok benzerdir ve burada hemoliz damar içerisindedir ve fragmanlı eritrositler(miğfer hücreler) eşlik eder. Retikülosit sayısı tedaviden sonra bu hastaların seyrini ve iyileşmelerini izlemek için kullanılır. Doğru retikülosit sayımı bu bozuklukların tedavisini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.
  • Hemolitik anemiler edinsel veya kalıtsal olabilir. En yaygın edinsel bozukluk otoimmün hemolitik anemidir. Trombotik trombositopenik purpura  yaşamı tehdit eden ve acil tedavi gerektiren diğer bir edinsel hemolitik hastalıktır. Bu hastalar doğru tedavi edilmediklerinde aniden ölebilirler. Trombotik trombositopenik purpuraya çok yüksek retikülosit sayısı eşlik eder ve bu tanı için ipucu olabilir. Kalıtsal bozukluklar ile bağlantılı diğer yaygın hemoliz nedenleri orak hücre anemisi ve G6PD eksikliğidir; bu eksiklik tüm dünyada ve özellikle Akdeniz ve Afrika’da milyonlarca insanı etkilemektedir. Bu hastalarda retikülosit ölçümü hemoliz hakkında fikir vermektedir.
  • Hemolitik hastalık durumunda, yüksek retikülosit sayısı kemik iliğinin durumunun belirlenmesine yardımcı olur ve hastada devam eden hemoliz veya kan kaybı miktarının hassas bir göstergesidir. Başlangıçtaki anemiye yüksek retikülosit sayısı eşlik etmişse, derhal ya kan kaybına ya da daha önemlisi hemoliz bulgularına bakılmalıdır. Bu, aneminin çok daha hızla incelenmesi gereken daha kritik bir nedenidir çünkü hemolitik bozuklukların çoğu acil müdahale gerektirir. Bu durumda, hastanın retikülosit sayısının yüksek olduğunun bilinmesi tanı ile tedavi arasındaki süreyi önemli ölçüde kısaltabilir.

Sonuç olarak retikülosit sayımı artık otomatik ölçüldüğünden, rutin kullanıma girdiğinde artık özel bir test olmaktan çıkacak, aneminin tanısını kolaylaştırarak hastanın tedavisini hızlandıracaktır. Mutlak retikülosit sayısı veya retikülosit üretim indeksi yüzdeye göre daha yararlı bir parametredir.Günümüzde retikülosit olgunluk parametreleri de pek çok klinik durumda yararlı olacaktır(209).

 

 

 

KAN SAYIM PARAMETRELERİ-4

PDFPrintE-mail

Written by selime Friday, 27 June 2014 22:15

            3.2. Trombosit Sayımı (PLT )

Trombositler çapı 2-4 mikron(µ) olan çekirdeksiz sitoplazmik fragmanlardır. Diğer kan  bileşenleri gibi, trombositler de manuel veya otomatik yöntemler ile sayılabilir. Manuel yöntemler kan örnekleri seyreltildikten sonra  faz kontrast mikroskobu(referans yöntem) kullanılarak sayım odacığında veya hemositometrede sayılır. Hata kaynakları diğer manuel sayımlarınki ile benzerdir; düşük trombosit sayıları ve dilüsyon hatalarıdır. Özellikle trombositopenik hastalarda CV %15’den büyük olabilir(132-133). Düşük kaliteli cihazlar dışında, şu anda hematoloji analizörlerinin birçoğu tam kan sayımının(CBC) bir parçası olarak  tam otomatik olarak trombosit saymaktadır. Kan sayımı cihazlarında trombositler, empedans veya optik scatter yöntemleri ile sayılır ve hacimleri (MPV, mean  platelet volume )ölçülür(132,134). Bu yöntemlerin CV’si %2’nin altında olduğundan trombosit sayımlarınının  güvenilirliği oldukça yüksektir. Trombosit kümeleşmelerinin, trombosit aglütininlerinin varlığı(135) veya trombositlerin lökositlere adzorpsiyonu  yalancı düşük trombosit sayılarına yol açabilir(136-137). Eritrosit  veya lökosit  fragmanları otomatik trombosit sayımını hatalı yüksek çıkarabilir ancak bu genellikle yalancı sonucu tanımlayan anormal histograma neden olur(138-139).

Eritrositlerde RDW’ ‘nin hesaplandığı gibi platelet distribution width (PDW ) ve plateletcrit (PCT) de hesaplanmaktadır.  Bazı cihazlarda büyük trombosit oranı ( P-LCR , platelet-large cell ratio ) hesaplanmaktadır.

Genç trombositler büyük olurlar. Normal trombositlerin % 10’nunu genç (büyük) trombositler oluşturur. Hematoloji analizörlerinde MPV otomatik olarak ölçülmektedir. Genellikle, MPV trombosit sayısı ile ters orantılıdır ve periferik yıkıma bağlı olarak trombositlerin azaldığı trombositopenik hastalarda yüksek, reaktif trombositozda ise düşüktür. Trombositlerde anizositoz ve makrositoz, aşırı kullanıma bağlı olarak trombosit yapımının arttığı durumlarda  idiyopatik trombositopenik  purpura’da görülür. MPV birçok hastalık durumları ile ilişkilendirilmiştir. MPV değerinin arttığı ve azaldığı durumlar Tablo’16 da belirtilmiştir(140-148). EDTA’lı kanda MPV in vitro koşullarda bir saat içerisinde artar, genellikle1-3 saat arasında stabildir ve sonra zaman içerisinde daha da artar. EDTA’daki bu belirgin volüm artışından disk şeklinden küre şekline geçiş sorumludur. Tekrarlanabilir ve güvenilebilir sonuçlar için, çok-kanallı cihazlarda MPV ölçümleri kan alındıktan  1-3 saat içerisinde yapılmalıdır.

          Tablo 16. Çeşitli Hastalıklarda MPV Değerleri

 

 

·        MPV karakteristik olarak hipertiroidide  ve miyeloproliferatif hastalıklarda artar. 

·        Nadir Bernard-Soulier sendromu olan hastalarda  ve miyeloptizisi olan hastalarda da MPV artar.

·        İmmün trombositopenisi olan hastalarda büyük trombositlerin sayısı artar.

·        İlik fonksiyonu yetersiz olduğunda folat eksikliği veya aplastik anemide  olduğu gibi MPV trombositopeniye rağmen düşük olabilir. 

·        Megakaryositik hipoplazi ve sitotoksik ilaç tedavisinde MPV azalır.

·        Aplastik anemi ve hipersplenizmde trombositler küçüktür

          Bu veriler kaynaklarda belirtilen 140-148 nolu literatürlerden alınmıştır.

 

      Bir kişide trombosit hacimlerinin sıklık dağılımı log normaldir. MPV’nin referans değerleri erişkinlerde yaklaşık 6.5-12 fL’dir. Ancak normal bireylerde MPV ile trombosit sayısı arasında lineer olmayan, ters bir orantı vardır. Dolayısıyla referans MPV değerleri trombosit sayısına göre değişkenlik gösterir(149).

3.2.1. Retiküllü Trombositler

      Retiküllü trombositler, eritrosit retikülositlerine benzeyen rezidüel RNA’nın korunduğu yeni salınan trombositlerdir. Retiküllü trombosit sayımı olgunlaşmamış trombosit fraksiyonu(IPF) olarak da ifade edilmektedir(150).

Retikülosit sayısının eritropezi göstermesi gibi, retiküllü trombosit sayısı da trombopezin(trombosit üretiminin) bir ölçütüdür Retiküllü trombosit sayımları trombopoez hakkında bir fikir verir. Genellikle retiküllü trombositler RNA’ya bağlanan tiazol oranj boyaları kullanılarak akış sitometri yöntemleri ile saptanır(151). Bu yöntemde tam kan Tiazol oranj boyasıyla inkübe edilir. RNA bağlanmasından sonra floresansda 3000 kat artış görülür. İnkübasyon karışımına eklenen fikoeritrin ile işaretlenmiş antikorlar trombositlerin diğer hücreler veya debristen ayırt edilmesini sağlar. Normal değerler %3-20 arasındadır. Retiküllü trombositlerin klinikte kullanılabileceği durumlar Tablo 17’de özetlenmiştir(151-160).

   Tablo17.  Retiküllü trombositlerin klinikte kullanıldığı durumlar

  • Trombositopenik olan hastaların izlenmesinde yararlı bir parametredir.
  • Retiküllü trombositlerdeki artış kemoterapiden sonra trombosit üretiminin yeniden başladığını gösterebilir
  • İdiopatik trombositopenik purpuranın klinik tablosunda retiküllü trombosit sayısında 2.5-4.5 kat artış olur.
  • 30. gestasyon haftasından daha küçük doğan bebeklerde retiküllü trombosit sayısı miyadında doğan bebeklerinkine göre yaklaşık 2 kat daha yüksektir.
  • Akut miyeloid lösemide kemoterapiden yaklaşık 20 gün sonra  retiküllü trombosit sayısı artar (bundan 2-3 gün önce periferik trombosit sayısı artar) ve bu bulgu stabil hastalarda profilaktik transfüzyon ihtiyacını azaltabilir.
  • Sık trombositoferez donörlerinde retiküllü trombositlerin ortalama düzeylerinin anlamlı olarak daha düşük olması, tekrar tekrar trombosit verilmesi trombopoezde anlamlı olarak tükenmeye yol açabilir.
  • Üremide rekombinant insan eritropoetini sadece aneminin düzeltilmesi yoluyla değil, aynı zamanda genç trombositleri arttırarak trombosit fonksiyonlarını iyileştiriyor gibi görünmektedir.
  • Aplazik hastalarda retiküllü trombosit sayısı azalır.
  • Hipertiroidizmde retiküllü trombosit sayısı artar ancak ötiroidizm sağlandıktan sonra sayısı azalır.
  • Karaciğer sirozunda retiküllü trombositlerin sayısında azalma görülebilir

             Bu veriler kaynaklarda belirtilen 151-160 nolu literatürlerden alınmıştır.

 

          Retiküllü trombositler stem cell transplantasyonundan sonra ve hematopoetik organ çıkarılmasını takiben trombosit iyileşmesini gösteren erken belirleyicisi( predictif değeri) olabilir. Retiküllü trombosit sayımı  Sysmex XE-2100 cihazında ölçülmektedir. Retikülosit sayımına benzer şekilde, bu testin diğer başka cihazlara eklenmesi beklenmektedir. Rutin olarak kan sayımına dahil edildiğinde retiküllü trombosit sayımlarının kullanımı ve yararı çok daha geniş çaplı olacaktır(41-43).  

3.2.2. Trombosit Sayımın Anlamı

Trombositlerin sayısal azlığı veya fonksiyonel bozukluğu klinikte birtakım bulgu ve semptomlara yol açmaktadır. Trombositopeni, kanama şikayeti olan hastalarda düşünülür veya hiçbir şikayeti olmayan hastalarda rutin kan sayımı sırasında ortaya çıkar. Genel olarak trombosit sayısı 100 000/mm3 ve üzerinde ise hastada majör cerrahide bile kanama olması beklenmez. 50-100 000 /mm3 arası değerlerde ağır travmalarda kanama normalden daha uzun  sürebilir. 20-50 000 /mm3 arası değerlerde hafif travmalarda bile  kanama olabilir. 20 000 /mm3 den daha küçük değerlerde kendiliğinden kanama olabilir ve özellikle 10 000 /mm3 altındaki değerlerde ciddi kanama riski vardır. Öncelikle trombositopeni bir hastalık değil bir bulgudur. Trombositopeni nedenini araştırılmak üzere kliniğe başvuran hastalardan alınan iyi bir hikaye ve yapılan fizik muayene ve birtakim temel laboratuar testleri ile etiolojik nedene ulaşılabilir. Hikayede trompositopeni yapabilecek hastalıkların semptom ve bulguları sorgulanırken özellikle ilaç kullanımı unutulmamalıdır(161).

 Trombositopenili hastada sadece kanama olmayıp, tam aksine heparine bağlı trombositopenide veya dissemine intravasküler kanamada olduğu gibi tromboz kliniğiyle de karşılaşılabilir. Fizik muayenede altta yatan hastalığa bağlı bulguların dışında trombositopenin derinliğine bağlı olarak peteşi, purpura, burun kanması, diş eti kanamaları, hematüri, menoraji, veya beyin kanaması saptandığı gibi tromboza bağlı bulgular da saptanabilir. Patofizyolojik olarak trombositopeniler yapım azlığı, yıkım artışı ve trombosit dağılımında bozukluk olarak sınıflanabilir(161).

Antikoagülan olarak kullanılan etilen diamintetra –asetik asit ( EDTA ) , kalsiyum iyonları ile kelat oluşturması sırasında trombosit membranındaki glikoprotein IIb-IIIa  molekülünü etkileyerek glikoprotein IIb epitopu  ortaya çıkarmaktadır. Bazı kişilerin kanında bulunan otoantikorlar  trombositlerin yüzeyindeki bu epitopa bağlanarak trombositlerin aglütine olmasına neden olurlar. Aglütine olan trombositler empedans ile ölçüm yapan kan sayımı cihazlarında lökosit olarak algılandıklarından trombositler normalden düşük sayılır. Kan sayımı sırasında binde bir oranında rastlanan ve “ Edetik asit aglütinini “ adı verilen bu antikorların yalancı trombositopeni teşhisi konmasından başka hiçbir klinik önemi yoktur. Bazı durumlarda da trombositler lökositlerin  çevresinde dizilerek(platelet satellitism) lökositlerle birlikte sayılırlar ve kan sayımı sonucunda trombosit sayısı yine düşük bulunur(97).

Trombositler, kan sayımı cihazlarında rutin olarak sayılmaya başlandıktan sonra yalancı trombositopeni teşhisi konan vakaların yanında klinik semptomatoloji vermeyen idiyopatik trombositopenik purpura ve esansiyel trombositemi vakalarının sayısı artmıştır(41).

Trombosit sayısı ile ilgili bir tereddüt olduğunda (trombosit sayısının normalden düşük veya yüksek olması, kan sayımı cihazının trombositlerle ilgili uyarı mesajı verdiği durumlarda) periferik yayma hazırlanarak trombosit sayısı kontrol edilmeli veya faz kontrast mikroskobunda trombosit sayılmalıdır. Dev trombositler beş parametre formül verilen cihazlarda nRBC’lerle karıştırılabilmektedir. Trombositlerin kümeleştiğini algılayabilen kan sayımı cihazları da vardır.

Periferik kan yayması trombositopenili her hastada yapılması gereken testlerin başında gelmektedir. Bu testle hastada gerçek anlamda trombositopeni olup olmadığı saptandığı gibi trombositopeni yapan nedene bağlı anormallikler de tespit edilebilir. Trombositlerin sayımı zordur çünkü küçüktürler ve debristen (yıkım ürünleri) ayırt edilmeleri gerekir. Güçlüğün diğer bir nedeni cama, herhangi bir yabancı maddeye ve birbirlerine yapışma eğilimleridir. Boyanmış periferik yaymaların dikkatli incelenmesiyle trombositlerin sayısında anlamlı azalma genellikle fark edilir. Kapiler kanda periferik yayma kan alındıktan sonra çok hızlı bir şekilde ve eşit olarak hazırlanmalı, böylece trombositlerin hasarlı damarların kenarlarına yapışması en aza indirilmeli ve kümeleşmeleri önlenmelidir. Daha iyi bir yöntem antikoagülan olarak EDTA’lı kan içeren venöz kandan hazırlanan boyanmış periferik yaymanın incelenmesidir; burada trombositler eşit şekilde dağılmıştır ve kümeleşme normalde oluşmaz. EDTA’lı kanda hazırlanan ve Romanowsky(referans boya) veya  diğer boyalarla boyanmış periferik yaymada trombositler oval veya yuvarlak, 2-4 mikrometre çapındadır ve birbirinden ayrıdır. Trombosit sayısı periferik kan yaymasından saptanabilir. Ortalama olarak, trombosit sayısı normal ise, her 10-30 eritrositte yaklaşık 1 trombosit bulunur. Bu 1000x büyütmede eritrosit morfolojisinin yoğun  olduğu bölgelerde her imersiyonlu saha başına  yaklaşık 7-20 trombosite karşılık gelir(41, 112). Manuel olarak  trombosit sayısını hesaplamak için periferik kan yayması kullanılabilir.

  • < 7 trombosit/ her immersiyon alanında(YİA) –azalmış trombosit sayısı
  • Yer yer kümelerle birlikte pek çok trombosit (7-20 trombosit/ YİA )–yeterli trombosit rezervi
  • > 25 trombosit/ YİA –artmış trombosit sayısı

10 yağ imersiyon alanlarındaki trombosit sayısı sayılır ve toplam rakam 2000 ile çarpılırsa, sonuç manuel yöntem ile elde edilen trombosit sayısına çok yaklaşır.

Trombositler genellikle sitoplazmayı dolduran ince mor granüller içerir. Bazen granüller ortada yoğunlaşır (granülomer) ve soluk sitoplazmayla (hyalomer) ile çevrilidir; bunlar muhtemelen trombositler ile aktive olur ve bu görünüm mikrotübüler bandın kontraksiyonundan kaynaklanır. Çok az sayıda trombositin granülleri azalmış olabilir (hipogranüler trombositler). Normal bireylerin EDTA’lı kanından periferik yayma  kan alındıktan 10 veya 20 dakika sonra hazırlandığında çapı 3 mm’den büyük trombosit fraksiyonu ve hipogranüler olan trombosit fraksiyonu %5’den daha azdır. Periferik yaymalar kan alımından hemen  veya üç saat sonra hazırlanırsa, büyük trombosit fraksiyonu ve hipogranüler veya aktive trombosit fraksiyonu artar. Bu artefaktlardan dolayı periferik yaymadan trombosit büyüklüğü belirlenirken periferik yayma hazırlama süresinin standardize edilmesi gerekir(41).

İmmün trombositopenisi olan hastalarda büyük trombositlerin sayısı artar. Nadir Bernard-Soulier sendromu olan hastalarda ve miyeloptizi veya miyeloproliferatif sendromları olan hastalarda da artar(162).

Deriye girerek alınan kandan hazırlanan periferik yaymalarda, trombositler sivri çıkıntılar ile birlikte düzensiz şekiller alırlar ve kümeleşme eğilimi gösterirler. Değerlendirmelerde buna dikkat etmek gerekmektedir(41).

          ReFerans Trombosit Sayım Yöntemi

          Referens işlem için; % 1’lik Amonyum Oxalate solüsyonu A sınıfı bir balonda 1:125 makrodilüsyon yapılarak 20-30 dakika bekletilir. Hücreler faz kontrast mikroskopi tekniği ile sayılır(163). Bu yöntem manuel hücre sayımları bölümünde anlatılmıştır.

           ICSH ‘ın Önerdiği Flow Sitometrik Yöntem

Trombosit tayımı için ICSH’in önerdiği metot aşağıda özetlenmişir(163).

ICSH Konseyi, hemoglobin, hematokrit, eritrosit ve lökosit sayımı için referans metotlar önermiştir. ICSH;

  • CBC sayımının tam kan kalibrasyonunda,
  • Hematoloji analizöründe kullanılan kalibrasyon maddeleriyle ilgili değerlerin belirlenmesinde ve

·       Gerekli metotların düzenlenmesinde trombosit sayımı için de referans metod gerektiğini söylemiştir. ICSH,  kesin bir tarifi olan, belirli uzmanlar tarafından trombosit sayımı için kullanılan, diğer laboratuar metotlarının geçerliliğini değerlendirebilecek kadar yeterli doğruluğa ve tutarlılığı olan bir referans metod tanımlamıştır. Referans metodun doğruluğu daha önceden tanımlanmış başka bir metotla karşılaştırılarak belirlenmeli ve yanlışlık ve tutarsızlık derecesi de belirtilmelidir.

            ICSH Uzman Panel’inde; trombosit sayımı için gerçek bir referans metodu bulunmadığı için hücre sayımı üzerine yapılan hematoloji analizörlerinin tam kan kalibrasyonunda kullanılan taze kanın trombosit sayımının yapılabilmesi için seçilmiş bazı metotların kullanılması önerilmiştir. Seçilen metotlar arasında; amonyum oksalat soulusyonu kullanılarak yapılan hemositometre faz kontrast mikroskopi ile hücre sayımı  ve hidrodinamik olarak fokuslanmış akım akış tekniğini kullanan aperture-impedance counterla(indirekt trombosit sayımı) ölçülen RBC/ trombosit oranının tayini    gibi metotlardır.

            Hematoloji analizörlerinin kalibrasyon ölçümlerine referans olabilecek doğru, güvenilir ve tutarlı trombosit sayımı elde etmek için için hala devam eden iki problem vardır.

(1) küçük trombosit sinyallerini taklit eden ve diğer gereksiz depris ve seslerden ayırmaktaki güçlükler, (2) trombosit sayımını enterfere eden çok fazla sayıdaki eritrositlerin elimine edilmesi gibi problemlerdir.

            Flüoresan akış hücre sayımı kullanımının artmasıyla birlikte, indirekt  yoldan yapılan trombosit sayımına (RBC/ Trombosit oranının belirlenmesi) olan ilgi yeniden başladı. İndirekt(dolaylı) yoldan yapılan sayma metotları, trombositler flüoresan olarak bütün trombositleri ayırt etmekte kullanılan özel bir monoklonal antikor ile işaretlendikten sonra  bir akış hücre sayacında gerçekleştirilir(Şekil 30). Kullanılan antikorlar arasında anti-CD42a, antiCD41b, anti-CD41, anti-CD42 ve anti-CD61 mevcuttur. Araştırmalar göstermiştir ki piyasada mevcut olan monoklonal antikorların herhangi biriyle yapılan flüoresan işaretleme spesifik ve gerçek anlamda evrenseldir.  Bir başka deyişle söz konusu durum, birbirinden  çok farklı kan örneklerinin hepsinde trombositlerin işaretlendiği anlamıma gelir. Modern akış hücre sayaçları, hazırlama ve sayım açısından pratiktir ve bunun yanında ayırt etme amacıyla kullanıldığında farklı hücrelerin birbirinden kolaylıkla ayrılmasını sağlar. Diğer taraftan, RBC-RBC, RBC-trombosit ve WBC-trombosit coincidence(rastlantıları) hücre sayımı için bir problem olarak kalmaktadır. Duyarlı bölgeler genellikle  tipik olarak 1,000 µm den büyük olduğunda ve lazer ışığının Gaussian dağılımıyla belirlenir. Algılama şiddeti zayıf olarak tanımlandığı için rastlantıya bağlı düzeltme genellikle yapılmaz. Rastlantı nedeniyle hata olmadığını kanıtlamak için seri halinde dilüsyonlar yapılmalıdır.

3.2.3.1. 1.Öneri

ICSH dolaylı yoldan yapılan; flüoresan hücre sayıcısı kullanılarak özel olarak işaretlenmiş trombositleri eritrositlere (RBC) oranlayan bir sayma metodunu önermektedir. Bu metot, yarı otomatik  ve tek kanallı bir aperture-impedance partikül sayıcısı kullanılarak belirlenmiş  doğru bir RBC sayımıyla birlikte uygulanırsa, hücre sayıcılarılarının tam kan kalibrasyonunu ve kalibrasyon maddelerini belirleyen değerlerin tayin edilmesinde yeterli bir doğruluk ve tutarlılık sağlar.

3.2.3.1. 2.Metodun Prensibi

          EDTA’lı kan örneği steril bir tampon çözeltide dilue edilir. Sonra, trombositler özel flüoresan antikorlar ile boyanır. Solüsyondaki boyanmış trombositler sayım konsantrasyonuna göre dilue edilir ve trombositler ve eritrositler akım sitometresinde sayılır. Eşik değer, flüoresan genliği ve dağılım genliği temeline göre trombositleri eritrositlerden ayıracak şekilde belirlenmiş bir akış hücre sitometresi kullanılarak sayılır. Eritrosit/trombosit oranı belirlenir ve trombosit sayısı; ICSH şartlarını karşılayan bir hücre sayıcısı kullanılarak örnekteki doğru bir şekilde bulunmuş eritrosit sayısı verileri kullanılarak hesaplanır.

3.2.3.1. 3. Kan Örnekleri

          Sağlıklı vericilerin veninden alınan taze kan örnekleri,  bir enjektör veya vakumlu yolla EDTA içeren tüplere alınır(K2EDTA, susuz, [CAS] numarası 25102-12-9, molekül ağırlığı 368.4, 1.4-2.0 mg/mL; K3EDTA, dihydrate, [CAS] 6550-24-8, molekül ağırlığı 442.5, 1.6-2.4 mg/mL). Eğer aynı kan örnekleri hematokrit ve eritrosit ortalama hacim ölçümleri için de gerekliyse, sadece K2EDTA kullanılmalıdır. Tam karışma için tüplerde yeterli miktarda hava olmalıdır. Görsel hemoliz ya da  çok küçük pıhtıların görülmesi durumunda, örnek kullanılmamalıdır. Kan örnekleri oda sıcaklığında (18oC-22oC) saklanmalı ve örnek elde edildikten sonra 4 saat içinde kullanılmalıdır. Örnekler sallanan ya da karıştırıcı olarak kullanılan bir cihazın üzerine konulmamalıdır. Eritrositlerin ve trombositlerin homojen dağılımını garantilemek için, ön-dilüsyon yapmadan ve antikor ile işaretlemeden önce, kan örneği en az 8 kere yavaşça altüst edilerek karıştırılmalıdır.

3.2.3.1. 4. Cam Eşyalar

          Orijinal örnek ya da herhangi dilusyon için kullanılan malzemelerin yüzeyine trombositlerin yapışması engellenmelidir. Bu sebeple, düz cam yüzeyler kullanmaktan kaçınılmalı ve örnekle ilgili yapılan işlemlerde polipropilen veya polistren kullanılmalıdır.

3.2.3.1. 5.  Cihaz Özellikleri

          Trombosit ve eritrosit sayımı için ; kullanılan flüoresansı ve ileri ışık saçınımını ölçen ve hidrodinamik olarak odaklayan bir flüoresans akış hücre sayıcısı kullanılır. Cihaz, 2 µm çapındaki küresel tanecikleri fluoresein izothiosyanat ile işaretlenmiş güvenilir bir şekilde saymak için saçılmış ve fluoresein floresan ışığa karşı yeterli hassasiyete sahip olmalıdır.

            Tam kan eritrosit sayımı için, yarı otomatik ve tek-kanallı bir aperture-impedance partikül sayıcısı kullanılır. Cihaz,  80-100 µm aralığında delik çapına ve çapın % 70-% 100’ ü kadar uzunluğa sahip olmalıdır, ve sayma periyodu sırasında yer değiştirilen hacmin doğruluğu % 1 içinde olmalıdır. Ulusal ya da uluslar arası metrolojik bir standarda göre izlenebilir olmalıdır(Not: Şu anda, tamamıyla doğru ve izlenebilir bir hacim yer değiştirmesini belirleyebilecek optik tanecik sayıcıları mevcut değildir).

3.2.3.1. 6. Malzemeler

3.2.3.1. 6. 1. Diluent (Seyreltici)

            Seyreltici olarak tamponlanmış fosfat tuzu(PBS), 0.01 mol/L, pH 7.2-7.4, ile birlikte 0.1 % bovine serum albümin (BSA) kullanılır. Basamaklar aşağıdaki gibidir:

1.     1.15 g dibazik, anhidr sodyum fosfatı (Na2HPO4; CAS, 7558-79-4; molekül ağırlığı, 142.0) yaklaşık olarak 750 mL deiyoinize ya da damıtılmış suda çözülür..

2.     210 mg monobazik, anhidr potasyum fosfat (KH2PO4; CAS, 7778-77-0; molekül ağırlığı, 136.1), 8.0 g sodyum klorür (NaCl; CAS, 7647-14-5; molekül ağırlığı, 58.44), 200 mg potasyum klorür (KCl; CAS, 7447-40-7; molekül ağırlığı, 74.55) ve 1.0 mL BSA, fraction V eklenir. Deiyonize ya da distile su kullanarak 1000 mL’ ye seyreltilir. 4 oC-8 oC arasında muhafaza edilir.

3.     Seyrelticiyi kullanmadan önce, ortalama gözenek çapı 0.2-0.25 µm olan bir low-binding, low-release zar filtre vasıtasıyla süzülür. (Millex-GV- Millipore Intertech, Bradford, MA- filtreleriyle iyi sonuçlar elde edilmiştir.

3.2.3.1. 6.2. Boyama Çözeltisi

            Boyama çözeltisini hazırlamak için, direkt olarak konjuge, fluoresein izotiosyanat ile işaretlenmiş antikorlar, trombositlerin glikoprotein IIb/IIIa kompleksi üzerindeki 2 ayrı epitope’ a karşı oluşan antikorlar kullanılır: CD41 ve CD61e karşı oluşan antikorlar.

            Not: Bir çalışmada; trombosit sayımları /µL ve /µL arasında değişen 65 kan örneğinin incelemeleri sonucunda, 17 kan örneği için farklı antikorla işaretlemeden kaynaklanan bir fark olmadığı; 25 kan örneği için anti-CD41 kullanılarak yapılan işaretlemede anti-CD61 ile yapılana kıyasla daha fazla trombositin boyandığı; ve 23 örnekte anti-CD61 kullanıldığında, anti-CD41 ile elde edilenden daha fazla trombositin işaretlendiği gözlemlenmiştir. Referans metod  ikili boyama tekniği gerektirir.

            Laboratuarlar, trombositlerin floresan olarak yeterli miktarda boyanması spesifik bir klonla veya bir dizi antikorlarla sonuçları doğrulamalıdır. Antikorlar bütün trombosit popülasyonunu temsil edecek kadar güçlü floresan bir sinyal oluşturmalıdır ki; sinyaller, logFL1(528 nm de flüoresans) ve log FS (ileri dağılım) grafiği çizildiğinde,  diğer gürültü, debris ve eritrositlerden tamamıyla ayrıştırılabilsin.

3.2.3.1.7. Eritrosit  ve Trombosit Sayım Prosedürü

Basmaklar aşağıdaki gibidir:

1.     100 µL filtreden geçirilmiş PBS-BSA seyrelticinin içine 5 µL iyi karışmış (örnek tüpünü yavaşça en az 8 kere altüst ederek) kan örneği pipetle  eklenir.

2.     5 µL anti-CD41 ve 5 µL anti-CD61 boyama çözeltisi eklenir ve 15 dakika karanlıkta ve 18oC-22oC de bekletilir.

Not: Tutarlı sonuçlar; kan,  anti-CD41 ve anti-CD61 boyama çözeltileri, reaksiyon tüpünün aşağısına ayrı damlalar olarak pipet ile bırakıldığında ve PBS-BSA seyrelticisi eklendiğinde elde edilmiştir.

3.     15 dakikadan sonra, sayım için 4.85 mL PBS-BSA seyrelticisi ekleyerek 1:1,000 oranında son bir seyreltme yapılır. Eritrositlerin  ve trombositlerin düzgün ve eşit bir şekilde dağıldığından emin olmak için, yavaşça altüst ederek iyice karıştırılır.

4.     Akış hücre sayıcısıyla minimum 50.000 sonuçta minimum 1000 trombosit sayılır. Akış hücre sayıcı ayarları her saniyede 3,000 sonucu garantiye alacak şekilde yapılmalıdır. Hem eritrosit sinyali hem de trombosit flüoresansı pozitif olan durumlarda, eritrosit-trombosit rastlantısal sonuçları olarak düşünülür, ve RBC ve trombosit sonuçlarının her ikisine birden eklenir.

Quadrant ya da nokta esaslı analiz kabul edilebilir, fakat nokta esaslı analiz tavsiye edilmektedir. Pozitif yer değiştirme pipetlerinin kullanımı önerilir.

3.2.3.1. 8. RBC Konsantrasyonunun Belirlenmesi

            Eritrositler ve lökositlerin sayımı için ICSH’ın önerdiği referans metot kullanılır. Orijinal kan örneğinde RBC konsantrasyonu yarı otomatik, tek kanallı bir aperture-impedance partikül sayıcısıyla belirlenir.

3.2.3.1. 9. Trombosit Sayısının Belirlenmesi

          Akış hücre sayımı verilerinden aşağıdaki formül kullanılarak en az 3 ondalık basamağa kadar RBC/trombosit oranı, R, belirlenir.

R= RBC ile ilgili durum sayısı/ Trombosit ile ilgili durum sayısı

Trombosit sayısını bulmak için, orijinal örnekte sayılan eritrosit  sayısını bu orana (R) bölünür.

3.2.3.1. 10.  Coincidence(Rastlantı)

          Ayarlamalar uygun şekilde set edilirse, rastlantısal düzeltmenin yapılmasına gerek yoktur. Bununla birlikte, analizin kurulum aşamasında, bazı düzeltme denklemleri önerilir. En uygun durumları (seyreltme, akış, veya kazanım hızı)  garantilemek ve bazı patolojik (örneğin, çok yüksek trombosit sayısı) örneklerle bağlantılı olası problemleri görüntülemek için önerilir.

3.2.3.1. 11.Tutarsızlık

Bütün hücre sayma metotlarında olduğu gibi, sonucun tekrarlanabilirliği üzerine olan temel bir kısıtlama örneklenen hücre sayısındaki istatiksel değişimle bulunur: Değişim sabiti (CV) 1/ hücre sayısının kareköküdür. Tanımlanan referans metodunda, oran, R; sabit bir toplam hücre sayısı bulunduktan sonra, iki sayının (trombosit sayısı, NPlt ve RBC sayısı, NRBC) oranından bulunur.

Hata yayılımı teorisi gösterir ki; bir oranın değişim sabiti (CV), ayrı ölçümlerin değişimlerinin kareleri toplamından bulunur.

Oldukça fazla sayıda RBC olmasından dolayı, NRBC aşağı yukarı Ntoplam olarak düşünülür ve denklemde NPlt için NRBC/R kullanılırsa, denklem RBC/PLT oranının fonksiyonu olarak sadeleştirilebilir.

CV2= (R+1)/Ntoplam ve

CV (%)= [(R+1)/ Ntoplam] X100

RBC/PLT oranının normal değerlerinin ortalaması 20 civarındadır. Bu değerde ve 50,000 Ntoplam değeriyle, istatiksel tutarsızlık % 2 dir. Pratik deneyimler,  280 ve /µL (280 ve /L) trombosit sayıları için, metodun tekrarında tutarlılık değerlerinin sırasıyla % 1.7 ve % 3 olduğunu göstermiştir.

3.2.3.1. 12. Problem Nedenleri

          Bu metotta kullanılan monoklonal antikorlarla işaretleme çok çeşitli örnek üzerinde etkili olmasına rağmen, örneğe özgül bir sorun çıkabilir. Problem, belirli örneklerde bağlanma yerlerinin bulunmamasından ya da boyama reaksiyonun engellenmesinden kaynaklanabilir. Olası problemlerin özeti Tablo’18 de verilmiştir. Bu sebeple, hematoloji analizörlerinin kalibrasyonunda kullanılan tam kan örneklerinin, listelenen durumlardan her hangi birini göstermediğinden emin olmak önemlidir.

 Tablo 18. Bazı Seçilen Durumlar İçin Trombosit Sayımında Karşılaşabilecek Olası Problemler

Hata Kaynağı

Etki

Durum

Sıklık

Çok fazla sayıda trombosit (trombosit aktivasyonu)

Dengesiz sayım

Thrombocythemia; thrombocytosis

Ara sıra

Oto-antikorlar

Bağlanma yerlerinin engellenmesi

Idiopathic thrombocytopenic purpura

Nadir

Doğuştan trombosit bozuklukları

Glikoprotein IIb/IIIa bağlanma yerinin bulunmaması

Glanzmann thrombasthenia

Çok nadir

Trombosit yığılması

Trombosit kümeleri

Beklemiş kan;

EDTA etkisi

Ara sıra

Trombosit- lökosit yapışması

Trombositlerin gate’in dışına çıkması

İzleyen kalp bypassı; EDTA

Ara sıra

Soğuk aglütininler

Eritrosit  kümeleri

Aglütinin bağlantılı bozukluk

Ara sıra

Parçalanmış eritrositler

Yanlış eritrosit sayımı

Hemolitik anemi; disseminated intravascular coagulation;

 HUS;

yapay kalp kapağı

Nadir

Parçalanmış lökositler (apoptotik parçaları da kapsayan)

Yanlış trombosit sayımı

Lösemi, özellikle kronik lenfösitik;

Kemoterapi

Ara sıra

Anormal trombosit büyüklüğü

Trombositlerin gate’in dışına çıkması

Trombositopeni; May-Hegglin anomalisi

 

Ara sıra

Veriler Am J Clin Pathol 115(3): 460-464, 2001 den alınmıştır.

3.2.3.1. 13. Değerlendirme

          Anti-CD41 ve anti-CD61 ile işaretleme metodu paralel olarak 11 laboratuarda (Fransa, Japonya, İngiltere ve A.B.D’de)  test edilmiştir; anti-CD41 ve anti-CD61’in bileşimiyle işaretleme 4 laboratuarda (İngiltere ve A.B.D’de) test edilmiştir. Her laboratuar stabilize madde ve trombosit sayıları farklı dağılım gösteren en az 60 hasta örneği analiz etmiştir. Bütün laboratuarlar mükemmel örnek analizleri ve laboratuarlar arası kabul edilebilir bir tutarlılık sergilemişlerdir. Genelinde, anti-CD41 ve anti-CD61 arasındaki korelasyonlar ve bu iki antikorun  anti-CD41 ve anti-CD61 ikili işaretleme ile korelasyonları açık bir ön yargı olmaksızın mükemmel bulunmuştur. Eritrosit  sayısını belirlemek için bir referans partikül sayacı yerine kalibre edilmiş otomatik hematoloji analizörü kullanmanın, trombositopeniler’de yapılan trombosit sayımının doğruluğunu belirlemede değerli bir araç olduğu gösterilmiştir.

ICSH/ISLH’ın önerdiği bu yöntem birçok literatürlerde yayınlanmıştır. Ançak klinik laboratuarlarda  rutin bir test olarak uygulanması düşündürücüdür.

 

   

Page 4 of 21

You are here: Home
Green Blue Orange Back to Top